腹腔镜以其微创、少痛和易恢复等优点使它在近年来的妇科手术中得到越来越广泛地使用。腹腔镜设备和技术也在不断改进与完善,不少学者尝试在腹腔镜下完成妇科恶性肿瘤的手术治疗,并取得了相应的进展。但随着腹腔镜在妇科恶性肿瘤的诊断和治疗中的应用,有关CO2气腹腹腔镜术后恶性肿瘤生长加快、易复发,尤其是戳口肿瘤种植转移率升高的报道越来越来多,其中尤以CO2气腹对恶性肿瘤的影响备受人们的关注,并成为近年来的一个研究热点。关于CO2气腹对恶性肿瘤影响,尚存有争议。有研究者认为,恶性肿瘤的种植和转移与CO2或腹腔镜治疗无关、而与肿瘤细胞自身的特性有关。但也有很多的研究者认为CO2气腹对恶性肿瘤的生长和转移有影响。而对于CO2气腹促进恶性肿瘤增殖的机制,国内外相关报道多集中在机体免疫因素、癌细胞局部微环境改变等细胞增殖分裂的外源性调控途径的研究,关于细胞增殖分裂的内源性调控途径方面的报道则甚少,因而缺乏充足的理论依据。本课题研究了CO2人工气腹条件下宫颈癌CaSki细胞体外生长以及周期相关蛋白CDK4和Cyclin D1表达情况,从细胞增殖分裂的内源性调控途径方面探讨CO2气腹促进恶性肿瘤增殖的机制。第一部分CO2气腹对人宫颈癌细胞株CASKI的生长和增殖的影响【目的】通过观察模拟腹腔镜实际操作条件下CO2作用不同时间对宫颈癌CaSki细胞体外生长、增殖能力的影响,评估CO2人工气腹对宫颈癌细胞体外生长、增殖的直接作用并探讨相关机制。【方法】模拟实际腹腔镜手术的操作环境,建立体外CO2人工气腹模型。以气压为15mmHg的纯CO2气体,分别作用于培养的宫颈癌CaSki细胞2h、4h。以未作任何处理的宫颈癌CaSki细胞为对照。分别采用四甲基偶氮唑盐比色方法(MTT法)测定继续培养1～5d后的宫颈癌CaSki细胞生长情况,绘制生长曲线;流式细胞仪PI染色法测定细胞周期并计算增殖指数。【结果】随着细胞培养时间的延长:①MTT法检测结果显示,在CO2处理后第2d,CO2处理2h组、4h组的光吸收值(OD值)均明显高于对照组(P<0.05),第3～5d各CO2处理组OD值均明显高于对照组(P<0.01);②与对照组相比,各CO2处理组细胞生长曲线的增幅从第2天开始逐渐增加,但第4～5d后增幅趋缓。③第1～5d的各时间点,CO2处理组的增殖指数均明显高于对照组(P<0.05);④CO2处理组比对照组细胞处于G0-G1期的比例显著降低(P<0.05),而进入S期、G2-M期的细胞比例显著增高(P<0.05);各CO2处理组的结果差异均无显著性(P >0.05)。【结论】宫颈癌细胞株CaSki在CO2气腹条件下处理后,其生长速度明显加快,细胞周期中处于增殖期的细胞比例显著增加。说明CO2可以促进宫颈癌CaSki细胞的增殖。第二部分CO2气腹对人宫颈癌细胞株CASKI中CDK4和CYCLIN D1表达的影响【目的】通过观察模拟腹腔镜实际操作条件下CO2作用不同时间对宫颈癌Caski细胞中细胞周期调控因子CDK4和Cyclin D1表达的影响,从细胞增殖的内源性调控途径的角度,研究CO2气腹对宫颈癌细胞体外生长、增殖的影响并探讨相关机制。【方法】模拟实际腹腔镜手术的操作环境,建立体外CO2人工气腹模型。以气压为15mmHg的纯CO2气体,分别作用于培养的宫颈癌CaSki细胞2h、4h,以未作任何处理的宫颈癌CaSki细胞为对照。用Western-blot及免疫细胞化学法检测周期调控因子CDK4和Cyclin D1在宫颈癌CaSki细胞中表达以及经CO2处理后在宫颈癌CaSki细胞中表达的变化情况。【结果】①Western-blot及免疫细胞化学结果均显示,CDK4和Cyclin D1在宫颈癌CaSki细胞中存在阳性表达;②Western-blot结果显示,CDK4和Cyclin D1在CO2处理组中的阳性表达明显强于对照组(P<0.01)。③免疫细胞化学结果显示,在培养的1～5d的各时间点上,CO2处理组细胞CDK4和Cyclin D1阳性表达的平均阳性光密度值(OD)相应地明显高于对照组。【结论】宫颈癌细胞株CASKI在CO2气腹条件下处理后,周期相关蛋白CDK4和Cyclin D1在宫颈癌CaSki细胞中表达明显增强。说明CO2可以通过影响宫颈癌CaSki细胞增殖的内源性途径促进其增殖。