水稻是世界上主要的粮食作物之一,是全世界半数以上(50%-80%)人口的主粮,由于水稻单一的种植方式,很容易受到外源病原物的侵害,从而严重影响水稻的产量和品质,因此,对抗病新基因的挖掘和使用才能从根本上解决这些问题。大量研究表明WRKY转录调控因子在植物应对生物和非生物胁迫的应答反应中起关键作用,这些研究,不仅有助于我们发现WRKY基因在抗病抗逆方面的重要作用,还能帮助我们发展新的抗病抗逆材料,以用于水稻的育种工作。实验室前期克隆了Os WKY7和OmWRKY7的基因序列,并对其基因功能及抗病性进行了初步研究,研究表明OsWRKY7和OmWRKY7编码的蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有转录激活活性。OsPVRKY7和Om WRKY7基因在根、茎、叶和花中都有表达且在叶片中表达量最高。OsWRKY7和Om WRKY7基因参与了水稻对生物胁迫(白叶枯病菌)的免疫应答反应,但具体的抗病机理尚不明确。为进一步了解OsWRKY7和OmWRKY7基因调控途径中的其它参与成员,本研究构建了相应的原核表达载体Os WRKY7-pGEX-4T-1和OmWRKY7-pGEX-4T-1,通过优化表达条件获得高纯度融合蛋白OsWRKY7-GST和OmWRKY7-GST,利用GST Pull-Down技术和质谱鉴定初步筛选与目的蛋白有互作关系的蛋白;用酵母双杂交试验验证蛋白之间的互作关系;通过BiFC技术验证(OsWRKY7/OmWRKY7的自身互作;构建Os奶WRKY7-Cas9转基因敲除材料,并对其抗病性进行初步研究,研究的主要内容如下:1.原核表达载体的构建及表达构建OsWRKY7-pGEX-4T-1和<OmlPrWRKY7-pGEX-4T-1原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞进行融合蛋白的表达及表达条件的优化,结果显示:融合蛋白OsWRKY7-GST和OmWRKY7-GST的表达是可溶性表达,最佳诱导表达条件是:IPTG终浓度0.5mM,20℃诱导表达6h。2.融合蛋白的纯化及GST Pull-Down筛选互作蛋白在最佳诱导表达条件下纯化到融合蛋白OsWRKY7-GST和OmWRKY7-GST,与水稻叶片组织总蛋白进行Pull-Down,质谱鉴定分析后,得到85个与融合蛋白OsWRKY7-GST和OmWRKY7-GST都有互作关系的蛋白,根据NCBI、RAP-DB、Uniprot和中国水稻数据库对这些蛋白进行分析,包括淀粉合成相关蛋白、信号传导途径中的受体蛋白、氧化还原蛋白、蛋白合成及代谢相关蛋白、防御相关蛋白、呼吸作用相关蛋白、光合作用相关蛋白和其他未知功能蛋白。3.酵母双杂交试验验证蛋白互作为了明确OsWRKY7及OmWRKY7转录因子的激活结构域,将全长蛋白进行了分段研究,分别在其C端、WRKY结构域和N端进行缺失,构建相应的自激活载体进行酵母自激活活性分析,确定两者的转录激活结构域位于N端的第51-75个氨基酸的区间内,并得到无自激活活性的蛋白片段Os/OmWRKY7-NT3,进行酵母双杂交验证蛋白互作,实验结果表明:选取的4个候选互作蛋白(OsAlbal、OsCSP2、OsGF14e、OsRACK1A)与目的蛋白均没有互作关系,可能是由于目的蛋白截短后改变了其构象,影响了蛋白功能,也有可能是由于候选互作蛋白与目的蛋白之间的互作关系为间接互作。4.OsWRKY7基因和OmWRKY7基因的自身互作构建OsWRKY7和Om WRKY7分别与nYFP和cYFP融合的BiFC载体,在烟草中进行瞬时表达,实验结果显示OsWRKY7和OmWRKY7在细胞核除核仁之外的核质区具有强烈的自身互作,证明它们在细胞核内能形成同源二聚体或多聚体,具备了 WRKY转录因子家族的特性。5.Os WRKY7 CRISPR/Cas9转基因材料的获得与初步分析构建了O WRKY7基因的CRISPR/Cas9敲除载体,获得了转基因植株。对To代转基因植株进行阳性鉴定及靶位点序列分析,结果表明:33株To代OsWRKY7-Cas9敲除材料中,有14个株系的靶序列没有发生突变,19个株系的靶序列发生突变,突变率为57.6%,其中13个株系靶序列的突变模式为纯合突变,纯合突变率为39.4%,6个株系靶序列的突变模式为复合突变。在13个纯合突变株系中有3种突变模式,其中突变模式1为PAM位点上游第3个位前少一个碱基“A”,突变模式2为PAM位点上游第2位前少一个碱基“T”,突变模式3为PAM位点上游第3位前少2个碱基“CA”,三种模式均导致启始密码子ATG缺失。而复合突变是在靶点处出现杂波峰,说明含有多种形式的突变。此外,对T1代突变植株的抗病性进行了初步检测,白叶枯接菌实验结果表明,OsWRKY7-Cas9敲除材料的病斑长度明显短于对照组,这表明OsWRKY7基因可能是水稻对白叶枯病抗性的负调控因子。