目的和意义FHL2（Four and a half LIM Protein 2）为新确定的癌基因,在胃肠道肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。关于FHL2下游的转录调控已有了一定的报道研究,但对其上游的相关调控尚无文献报道。本研究拟对人新癌基因FHL2 5′端上游进行生物信息学分析以预测其5′端启动子位置和转录调控元件。结合文献,通过软件筛选出转录因子Sp1（Specificity protein 1）为可能的调控因子,明确Sp1与FHL2上游启动子序列的转录调控关系,从而寻找能靶向调控FHL2表达的元件,以期应用于肿瘤的生物靶向治疗。材料和方法1、主要材料Kato-Ⅲ、SW480和LoVo细胞,双荧光素酶报告基因检测试剂盒,核蛋白提取试剂盒,poly（dI-dC）,γ-³²p,LipofectAMINE2000 Reagent,TRIzol,Sp1抗小鼠单克隆抗体,FHL2抗兔多克隆抗体,Mithramycin A。2、方法2.1 FHL2基因5′端上游序列的生物信息学分析利用NCBI基因组数据库查找FHL2基因全长编码基因。将5′端上游序列用DBTSS软件分析得出转录起始位点及启动子区域,TFsearch软件分析可得出FHL2启动子区的转录调控元件及可能与启动子结合的转录因子。根据转录因子Sp1结合位点使用Primer 5.0分析设计得出4段不同长度启动子的引物。2.2 FHL2基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建以SW480细胞中提取的全基因组DNA为模板,使用Hotstart聚合酶扩增FHL2 5′端上游中的4段启动子片段,长度分别为1008bp、881bp、595bp和382bp。扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化回收,用NheⅠ酶和KpnⅠ酶各10units酶切1小时后,将酶切产物连入酶切后的pGL3-Basic载体（4℃连接16h）,转化。转化的菌液铺在含Amp抗性的LB琼脂平板上培养过夜,挑选阳性克隆扩增质粒,经KpnⅠ和NheⅠ双酶切鉴定出阳性克隆,做测序反应鉴定。2.3 FHL2重组启动子报告基因活性检测含2 mmol/L谷氨酰氨和10%FBS的1640培养液常规培养各细胞。在转染前1天将2×10⁴细胞接种于24孔板,37℃,5%CO₂孵箱培养至次日70%～80%铺满时进行转染。pRL-CMV载体用于标化报告基因活性。每孔分别转入重组质粒0.8μg和pRL-CMV质粒0.008μg,转染4～6 h后,换为完全培养基继续培养,48h后小心吸去孔中的培养基,加入足量的PBS洗涤培养孔,每孔中加入50μl1×PLB（Passive Lysis buffer,裂解液）,室温摇动孵育15 min,充分溶解转染细胞,吸取细胞裂解液至1.5 mL离心管中,12000g离心5min,吸取上清液。按照双荧光报告系统的说明书进行操作,分别检测得到萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光值,二者的比值即为相对荧光表达量（RLU值）,代表启动子的活性。每组实验至少重复3次,取平均值。2.4免疫组织化学使用免疫组织化学即用型二步法检测胃肠组织中Sp1和FHL2表达及相关情况。兔抗FHL2多克隆抗体为本实验室自备（1:300稀释）,小鼠抗Sp1单克隆抗体为Abcom产品（1:200稀释）。所有切片结果采用双盲法,有两个病理科医师独立阅片评分,Sp1阳性表达部位位于细胞核,FHL2阳性表达部位位于细胞核和/或细胞浆,呈棕黄色或棕褐色。每张切片随机选取3～5个不同高倍视野（400×）进行观察。染色结果综合染色强度及阳性细胞百分数两个方面进行半定量分析。指标染色强度判定:无染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,黄褐色为3分。阳性细胞百分数判定:每个视野计数100个细胞,取其平均值。阳性细胞百分数＜5%为0分,5%～20%为1分,20%～60%为2分,＞60%为3分。将染色强度与阳性细胞百分数分值相加即为切片各指标最终得分:0～1分为阴性（-）,2分为弱阳性（+）,3～4分为阳性（++）,5～6分为强阳性（+++）。2.5细胞核蛋白抽提首先按照说明书配置PBS/Phosphatase Inhibitors,1×Hypotonic Buffer,Complete Lysis Buffer,存放于冰上;然后将培养皿中细胞用冷PBS洗一次,加入1 ml PBS/Phosphatase Inhibitors;刮下细胞收集于1.5 ml EP管中,3000 rpm,4℃离心5min;弃上清,加入0.25ml 1×低渗缓冲液重悬沉淀,在冰上静置15 min;加入12.5μl Detergent,振荡混匀仪最高速10～20s;4,000g,4℃离心30s;弃上清,往沉淀中加入25μl完全裂解液,立即混匀,置振荡混匀仪150rpm,4℃,30min;振荡混匀仪最高速30s;14,000g,4℃离心15min。小心吸取上清,用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,根据浓度稀释为2μg/μl,-70℃保存。2.6凝胶阻滞实验使用TFsearch软件分析得到转录因子Sp1结合位点,根据结合位点设计结合探针。T4连接酶将5μCi[γ-³²p]标记至双链DNA探针,使用纯化柱将未标记的探针去除。先计算所需的Gel Shift Binding 5×Buffer的大致量,加入0.5μg/reaction poly（dI-dC）,混匀;标记1.5 ml EP管,依次加入2μl Gel Shift Binding5×Buffer,nuclease-free water,2μg核提取物混匀,室温孵育10min;然后加入相应的γ-³²p标记的探针,室温再孵育20min。上样至5%非变性PAGE胶中电泳120V 1h。用保鲜膜包住干燥过的胶,装入片夹,压上胶片,-70℃6～15 hr后显影、定影。2.7定点突变重组质粒并检测其活性变化根据说明书设计突变引物,以pLuc-595为模板进行扩增得到Sp1结合位点突变的产物。产物用DpnI酶切（对甲基化及半甲基化位点特异）可将未突变的模板质粒清除,然后转化入Epicurian coli XLl-Blue感受态细胞扩增成功突变的质粒,测序鉴定后命名为pLuc-MT。将突变质粒转染入细胞内24～48h后收集细胞进行双荧光素酶报告基因检测。2.8 siRNA及MIT抑制Sp1的表达后检测启动子活性变化根据Sp1 cDNA（NM 138473.2）设计合成Sp1-siRNA片段长度21bp,序列为AAAGCGCUUCAUGAGGAGUGA,阴性对照siRNA（Negative control siRNA）片段为UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。按照说明书操作,Kato-Ⅲ、SW480和LoVo细胞种于24孔板过夜,次日使用1μl/孔LipofectAMINE2000 Reagent将siRNA 100 pmol/孔转染入细胞中,同时设置另一组加入MIT（终浓度为1μM）,24～48h后收集细胞进行双荧光素酶报告基因检测。2.9 siRNA及MIT抑制Sp1的表达后检测FHL2 mRNA及蛋白水平变化使用LipofectAMINE2000 Reagent将siRNA 500 pmol转染入6孔板培养细胞中,同时设置另一组加入MIT（终浓度为1μM）,24～48h后收集细胞提取RNA及蛋白,进行RT-PCR及Western Blotting检测FHL2的表达。2.10数据统计双荧光素酶报告基因检测、RT-PCR和Western Blotting灰度值分析结果用三次实验结果的（?）±SD表示,两组采用两独立样本t检验;多组间方差齐者采用方差分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用LSD法,方差不齐者采用Welch检验分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用Games-Howell检验。免疫组化结果癌旁组织和肿瘤组织Sp1和FHL2阳性等级的比较采用非参数检验,Sp1和FHL2两者表达情况采用相关分析。统计处理采用SPSS 13.0软件,检验水准以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、FHL2基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定扩增了4段FHL2基因5′端上游启动子序列,大小分别为1008bp、881bp、595bp及382bp。上述片段分别插入到pGL3-Basic载体构建成重组质粒,命名为pLuc-1008、pLuc-881、pLuc-595及pLuc-382。酶切鉴定与荧光素酶基因片段相符,证实载体构建成功。DNA测序报告显示与Genbank中序列完全吻合。2、胃肠癌细胞株中FHL2重组启动子报告基因活性检测pGL3-Basic载体含有荧光素酶基因序列,并且载体本身不包含启动子,克隆入启动子后可用荧光素酶定量直观地比较两个启动子的活性及其在各种不同种类细胞系中表达的组织特异性,并以pRL-CMV质粒作为内参以消除转染效率的不同所带来的差异。重组质粒转染不同胃肠癌细胞后,荧光素酶活性RLU值（相对荧光单位）有不同的改变,表明所构建的FHL2基因启动子报告系统有转录活性。4个不同的重组质粒在胃癌Kato-Ⅲ细胞中活性分别为22.34±5.43,20.19±3.85,38.05±2.04和5.25±1.10;肠癌LoVo细胞中活性分别为4.30±0.85,4.65±0.68,9.46±2.31和3.10±0.51;肠癌SW480细胞中活性分别为2.68±0.15,2.02±0.08,3.31±0.23和1.85±0.42。3株肿瘤细胞中均为pLuc-595的RLU值最高（方差分析/Welch整体检验,F/Welch值分别为43.421,20.682和7.345,P值分别为0.000,0.000和0.038）。3、免疫组织化学验证Sp1表达与FHL2表达成正相关收集大肠及胃的癌旁粘膜和肿瘤组织石蜡标本进行免疫组织化学检测。Sp1在40例癌旁肠粘膜组织中,表达为阴性的有22例,弱阳性的有8例,阳性的有8例,强阳性的有2例,平均秩为32.98;在44例肠癌组织中,表达为阴性的有12例,弱阳性的有3例,阳性的有16例,强阳性的有13例,平均秩为51.16,表达较癌旁组织增强具有显著性（两等级资料秩和检验,P=0.000）;在13例癌旁胃粘膜组织中,表达为阴性的有10例,弱阳性的有3例,无阳性及强阳性表达,平均秩为10.04;在15例胃癌组织中,表达为阴性的有4例,弱阳性的有5例,阳性的有4例,强阳性的有2例,平均秩为18.37,表达较癌旁组织增强具有显著性（两等级资料秩和检验,P=0.000）。FHL2在34例癌旁肠粘膜组织中,表达为阴性的有33例,弱阳性的有1例,无阳性及强阳性表达,平均秩为21.72;在38例肠癌组织中,表达为阴性的有8例,弱阳性的有7例,阳性的有15例,强阳性的有8例,平均秩为49.72,表达较癌旁组织增强具有显著性（两等级资料秩和检验,P=0.000）;在12例癌旁胃粘膜组织中,表达为阴性的有10例,无弱阳性表达,阳性的有1例,强阳性的有1例,平均秩为8.79;在16例胃癌组织中,表达为阴性的有1例,弱阳性的有4例,阳性的有7例,强阳性的有4例,平均秩为18.78,表达较癌旁组织增强具有显著性（两等级资料秩和检验,P=0.000）。对同时进行了Sp1和FHL2的表达检测的34例大肠癌病人使用相关分析Spearman检验得到R=0.469,P=0.005,提示Sp1表达与FHL2表达相关,且随着Sp1表达量增高FHL2的表达量也增高。4、Sp1能与FHL2启动子特异结合根据TFsearch软件分析得出FHL2启动子上游中Sp1可能的转录结合位点设计了两对探针分别为:探针1:（-485） 5′agagggcccgggcttggaatgt3′（-464）,探针2:（-123） 5′tgccaccgcgcccaggcctcgt3′（-102）。以肠癌SW480细胞核提取物进行结合反应,电泳后曝光,标记的探针1+核蛋白抽提物泳道中出现一条特异的结合带,使用50倍未标记的探针1冷竞争反应后条带消失,而探针2泳道中未发现条带。提示探针1能与目的核蛋白中的Sp1特异结合,而探针2不能与转录因子Sp1结合。使用标记的突变探针1进行竞争反应该条带消失,进一步证实了Sp1能与FHL2启动子特异结合。5、定点突变FHL2重组启动子后报告基因检测活性下降根据凝胶阻滞实验结果,按照定点突变试剂盒设计突变引物将探针-485agagggcccgggcttggaatgt-464中Sp1位点突变为agaggAccAggTcttggaatgt。突变后的质粒经测序鉴定证实。将pLuc-595和pLuc-MT分别转染入Kato-Ⅲ、SW480和LoVo细胞中比较荧光素酶活性变化。三株细胞中pLuc-MT的RLU值均较pLuc-595的RLU值降低具有显著性（两独立样本t检验,t值分别6.218、42.772和8.377,P值分别为0.003、0.000、0.001）。6、siRNA及MIT抑制Sp1表达后FHL2重组启动子报告基因检测活性下降在三株细胞中MIT实验组启动子活性较阴性对照组活性下降均有显著性差异（P均＜0.05）。SW480和LoVo细胞Sp1-siRNA实验组启动子活性较阴性对照组活性下降有显著性差异（P均＜0.05）;但Kato-Ⅲ细胞Sp1-siRNA实验组的RLU值较阴性对照组RLU值下降无统计学意义（P＞0.05）。7、siRNA及MIT抑制Sp1表达后FHL2 mRNA及蛋白表达下降Kato-Ⅲ、SW480和LoVo三株细胞中的Sp1-siRNA实验组和MIT实验组Sp1 mRNA水平均较阴性对照组中Sp1 mRNA水平显著降低（P均＜0.05）,提示设计的Sp1-siRNA能有效抑制Sp1的mRNA表达。实验组FHL2 mRNA水平较阴性对照组FHL2 mRNA水平也有显著性降低（P均＜0.05）。蛋白水平的检测也有类似的结果（P均＜0.05）。结论获得了新癌基因FHL2的5′端启动子序列及转录调控信息,根据Sp1结合位点设计克隆的1008bp、881bp、595bp及382bp大小的FHL2启动子片段在胃肠癌细胞中有不同的转录活性,其中以pLuc-595活性最高。临床标本免疫组织化学检测提示Sp1和FHL2在胃肠道肿瘤组织中均较癌旁正常组织高表达,且随着Sp1表达量增高FHL2的表达量也增高,两者在肿瘤组织中的表达量成正相关。通过EMSA进一步证实了Sp1能与FHL2 5′端启动子序列特异的Sp1结合位点结合,突变该Sp1结合位点及抑制Sp1表达后均可发现FHL2转录活性及表达下降。以上结果均提示Sp1在一定程度上参与了FHL2的转录调控,抑制Sp1可下调FHL2的表达,FHL2启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件应用于肿瘤的生物治疗。