黄龙病,其英文以汉字拼音Huanglongbing命名的柑橘病害,由内生的、只在筛管细胞生长的、难培养韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)所引起,目前我国只发现亚洲种韧皮部杆菌。柑橘黄龙病是世界柑橘产业的一种毁灭性病害,已经造成巨大的经济损失。黄龙病病原菌的人工培养是攻克黄龙病病害的关键所在,迄今为止,国内外投入了大量人力和物力研究柑橘黄龙病病原菌的人工培养,但仍无法获得病原菌纯培养,极大限制了对黄龙病的病原学及其致病机理的研究以及病害防治。纵览此前的研究大都受限于纯培养的传统思路,对靶标病原细菌难培养特性的本质与成因认识存在误区,忽略了环境中共生微生物与靶标菌之间的互作关系。本研究改变传统纯培养的研究思路,以罹病柑橘寄主植物组织为培养实验材料,优化培养基配方及最适培养条件,将黄龙病菌与其共生菌共培养,凭借高效灵敏的实时荧光定量PCR检测方法监测靶标细菌的种群数量动态变化;筛选鉴定对病原菌具有促生作用的伴生微生物,旨在建立一种模拟原生态的病原细菌和伴生菌的共培养体系,实现病原菌的增殖培养。自广西、广东、福建、浙江、湖南等柑橘园采集柑橘黄龙病病树组织样品(根系、枝条、叶片和果实)作为供试材料。通过优化,确定以黄龙病菌含量最高、其他共生微生物较少的罹病柑橘植株果实橘络为培养实验材料,95%高浓度乙醇表面灼烧消毒法为样品前处理方法。在前人工作基础上,经过反复改进,研制出适合柑橘病组织黄龙病菌共培养基(MCLA培养基)配方,配方组分包括QS诱导物、生长因子、抗生物氧毒害剂、杀真菌剂、自然环境物质,以磷酸盐缓冲液调整p H为6.4;确定最适培养条件为28℃避光微需氧条件下静置培养,定期以实时荧光定量PCR方法(Quantitative Real-time PCR,q PCR)对培养的黄龙病菌进行监测,了解黄龙病菌增殖情况。经表面消毒后,按内生细菌分离法进行需氧和微需氧分离培养获取伴生菌。将所获伴生菌加入柑橘黄龙病菌培养体系,在兼性厌氧条件下与柑橘黄龙病菌共培养,定期取培养液进行q PCR检测,测定柑橘黄龙病菌增殖情况。筛选出对黄龙病菌生长具有促生性伴生菌3株及抑制性伴生菌5株;设计优化的黄龙病菌液体共培养体系能够使黄龙病菌在液体培养基中稳定增殖,经实时荧光定量PCR监测,黄龙病菌连续增殖量最高可达50倍,基本实现了黄龙病病原菌与伴生菌的共培养,建成了较稳定的共培养体系。黄龙病菌共培养体系的建成不但可以推动黄龙病病原学、病原生物学等基础研究,还有助于黄龙病杀菌剂的研制与开发、病害早期诊断和治疗性抗体研制等应用基础研究,为全世界柑橘黄龙病的病害防控开辟全新的途径。