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肺神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor,NET)由具有多向分化潜能的肿瘤干细胞形成,与普通型肺癌相比,其不仅在组织形态上具有明显的异质性,而且在肿瘤生物学行为以及对药物治疗的反应性上也存在着显著差异。肺NET可以生成多种神经内分泌(NE)标志物和活性激素,主要包括:嗜铬素蛋白A(CgA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、肾上腺皮质激素(ACTH)、抗利尿激素(ADH)等,这些异位激素的产生,可引起内分泌、神经、消化、造血、肾脏、骨关节及皮肤等系统和器官发生病变,并出现相应的临床表现,在临床上统称为“副肿瘤综合症”。小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)属于神经内分泌肿瘤的一种。关于它的起源,目前存在着两种观点:一种认为它起源于支气管粘膜上皮内Kulchitsky细胞,而另一种则认为它是由支气管粘膜干细胞分化而来。在肺癌中,小细胞肺癌的发生率较高,仅低于肺鳞癌及腺癌,其发生率约占原发性肺癌的20%-25%。本癌的恶性度极高,生长迅速,多数存活期不超过一年,因多有早期转移,一般不适合手术切除,目前小细胞肺癌的治疗及预后尚无突破性进展。Notch信号转导途径与许多肿瘤的发生和发展关系密切,在许多肿瘤细胞系中检测到Notch基因表达的异常,且紊乱的Notch途径在维持肿瘤表型方面起着重要作用。Notch基因编码一种300 kD的跨膜蛋白受体,受体的细胞内区是Notch的活化形式,当受体与配体结合时,Notch受体经γ一分泌酶水解剪切并释放其胞内段的活性部分(NIC),随后,NIC转移至细胞核内,与转录因子结合调控下游基因表达。在哺乳动物中NIC的直接靶蛋白包括CBF-1,当CBF-1与NIC结合后,通过蛋白的构象改变使原先被抑制的位于CBF-1结合序列下游的基因开放表达。Notch途径的下游基因包括HES基因家族和细胞周期相关蛋白基因。HES基因家族编码一类含有特征性α螺旋-环-螺旋(αHLH)结构的DNA结合蛋白,它可结合在hASH1基因的启动子上,从而抑制该基因的转录。迄今,有关肺癌神经内分泌分化的调节以及维持的分子机制尚不十分清楚,但有研究表明,hASH1基因的表达与肺神经内分泌肿瘤的分化表型和分化程度密切相关。因此Notch信号途径就可以通过靶基因HES对分化效应基因hASH1的抑制,来间接地对肺神经内分泌肿瘤进行调控。目前,已经有人对Notch信号途径在小细胞肺癌中的调控进行了研究,但研究的内容还局限于分子调控机制和形态学等方面,如Notch1可引起小细胞肺癌细胞中hASH1表达的显著降低,Notch信号途径可以抑制小细胞肺癌的生长和增殖等。在胰腺癌当中,Notch信号途径可以抑制神经内分泌肿瘤细胞标志物的生成,但在肺的神经内分泌肿瘤中还未曾有过这方面的报道。因此我们考虑采用重组质粒转染的方法,在小细胞肺癌细胞株中表达组成性活化的Notch1,来研究Notch信号途径对小细胞肺癌的调控作用,特别是转染前后癌细胞神经内分泌标志物表达的变化,通过以上研究,为目前缺乏有效治疗手段的小细胞肺癌患者提供治疗的新思路。材料和方法本实验采用的小细胞肺癌细胞株为NCI-H446。重组质粒PEFBOS-NIC-MYC由第四军医大学遗传与发育生物学教研室惠赠。首先我们把获得的质粒转染到感受态大肠杆菌中,进行了质粒抽提并送到公司测序,测序结果出来后我们对重组质粒进行了稳定转染,同时设定两个对照组(即转染空白质粒组BOS-446和未转染组control-446),待药物筛选获得稳定细胞株后,进行扩大培养,最后通过RT-PCR方法对各组细胞的Notch1、HES1及hASH1基因表达进行检测,通过MTT实验对三组细胞的增殖活力进行了对比分析,应用免疫细胞化学标记和Western blot技术对转染前后NE细胞标志物(CgA、NSE)的变化进行了检测。结果1.RT-PCR检测目的基因和下游基因的表达:在两个对照组中(control-446和BOS-446)并没有发现Notch1、HES1基因的表达,而在转染组中(NIC-446)发现了Notch1、HES1基因的表达。在两个对照组中有hASH1的表达,而在转染组中hASH1的表达明显降低。2.细胞活力分析:我们对三组细胞的细胞增殖情况进行了对比分析,各组细胞以2X10~3/孔接种至96孔板(3复孔),连续六天用MTT法测定细胞增殖活力,结果发现转染组的细胞活力明显降低,与对照组(control-446和BOS-446)之间有显著差异(P=0.037和0.043,t检验)。3.免疫细胞化学染色结果:三组细胞爬片后进行了免疫细胞化学标记,爬片应用图像分析系统进行灰度分析,与对照组相比,转染组的这两种神经内分泌标志物的表达量显著降低,差异均具有统计学意义(P＜0.001,t检验)。4.Western blot检测目的蛋白和神经内分泌标志物的表达:在转染组中存在NIC-MYC融合蛋白的表达,在对照组中未见目的蛋白的表达。在两个对照组细胞中,NE标志物CgA、NSE具有明显的表达,表现为条带较亮,而在转染组中,两个蛋白的表达量显著降低,表现为条带较暗。用凝胶成像分析系统Quantityone对条带密度进行半定量分析,结果发现转染组细胞神经内分泌标志物的表达与两对照组相比均显著降低(P＜0.001,t检验)。结论1.首次证实了Notch信号途径可以抑制小细胞肺癌神经内分泌标志物的表达,这将对小细胞肺癌患者的基因治疗提供理论依据,为进一步研究肺NET开辟了新思路,具有实用价值。2.Notch信号途径对小细胞肺癌的调控可能是通过靶基因HES1对分化效应基因hASH1的转录抑制来实现的。3.Notch信号途径可以抑制小细胞肺癌细胞的增殖。