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第一部分恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒逆转录酶基因序列特征目的:分析核苷(酸)类似物(NAs)治疗后恩替卡韦(ETV)耐药慢性乙型肝炎(CHB)患者乙型肝炎病毒(HBV) P编码区逆转录酶(RT)基因序列特征。方法:研究对象选自2006年4月至2011年2月在苏州大学附属第一医院门诊或住院接受NAs治疗后发生病毒学突破或反弹的730例CHB患者,PCR方法扩增患者的血清HBV RT基因,产物直接测序,用Chromas2.0软件分析HBV RT基因的核苷酸、氨基酸差异及变异类型。结果:共发现ETV耐药变异29例,其中LAM诱导的ETV耐药6例(26.09%),ETV序贯拉米夫定(LAM)后诱导的ETV耐药23例(73.90%)。测序结果发现,RT基因ETV耐药变异有rtT184、rtM250和rtS202G,分别为15例(62.07%)、8例(27.58%)和6例(26.09%),变异类型包括T184V/A/G/I/S /M、M250I/L/V和rtS202G。29例均伴有rtM204I/V变异,其中22例伴有rtL180M变异。测序发现新的氨基酸替代包括A165C、S168C、P170S、S172M、V175I、V183G、V207M/I、V214A、A222T、S223A、I224V、F226T/C、N227T、L229M、T237P、N248H、I254M、V256S等。结论:LAM或ETV序贯LAM治疗诱导ETV耐药变异,其RT区主要变异模式是LAM耐药变异(rtM204I/V伴或不伴rtL180M变异)与ETV耐药变异rtT184、rtM250或rtS202G同时出现。RT区ETV耐药变异的常见类型有rtT184I/G/S、rtS202G及rtM250L/V。第二部分阿德福韦酯联合恩替卡韦或阿德福韦酯联合拉米夫定挽救治疗恩替卡韦耐药慢性乙型肝炎患者疗效研究目的:评价口服阿德福韦酯(ADV)(10mg/d)联合ETV(0.5mg/d)或阿德福韦酯联合LAM(100mg/d)挽救治疗ETV耐药CHB患者疗效。方法:2006年4月至2011年2月在苏州大学附属第一医院门诊或住院接受NAs治疗后发生病毒突破或反弹的CHB患者,发生ETV耐药变异的患者29例,根据治疗方案不同随机分为两组,A组:ADV10mg/d +ETV0.5mg/d,B组:ADV10mg/d+LAM100mg/d,分别于基线、12周、24周、48周、96周检测肝肾功能、乙肝血清标记物和血清HBV DNA载量。B组24周内血清HBV DNA下降<2log10copies/ml的3例患者调整治疗方案:ADV10mg/d联合ETV0.5mg/d,继续监测、随访。结果: A组21例,B组8例,平均疗程69周(9~92周),B组1例患者于疗程第9周死于慢性肝衰竭。治疗第24周两组患者血清HBV DNA较基线水平平均下降2.87±0.98和1.62±1.01 log10copies/ml(p=0.033);两组血清HBV DNA阴转率分别为2/19(10.53%)和1/7(14.29%),(p=0.096)。第48周两组患者血清HBV DNA较24周进一步下降1.0±0.89和1.06±1.25 log10copies/ml(p=0.096);两组分别有8例和2例患者血清HBV DNA阴转(52-82周),其中3例发生HBeAg血清学转换。治疗24周内血清HBV DNA下降<2 log10copies/ml的患者共8例(A组3例,B组5例),呈下降趋势的5例(A组3例,B组2例)患者,延长疗程至第48周血清HBV DNA阴转率为80%(4/5)(A组2例,B组2例);B组24周内血清HBV DNA无下降趋势的3例患者,调整治疗后第24周,血清HBV DNA较前进一步下降2.84±0.65 log10copies/ml,第48周,2例患者血清HBV DNA阴转。治疗过程中,除A组1例患者发生一过性蛋白尿,两组患者未发生严重不良事件。结论:ADV联合ETV或LAM可用于ETV耐药CHB患者的挽救治疗,但疗效有限,联合ETV疗效优于联合LAM,根据患者应答情况延长疗程或调整治疗方案均可进一步提高疗效。第三部分恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒全基因扩增、分析及质粒构建目的:改良HBV全基因聚合酶链式反应(PCR)扩增技术,扩增并分析ETV耐药HBV全基因序列,构建含ETV耐药变异的HBV全基因组病毒载体。方法:优化样本抽提、PCR扩增方案(聚合酶、反应条件),改良HBV全基因扩增技术;扩增19例ETV耐药CHB患者外周血HBV全基因组,以GenBank中HBV序列为标准,用Chromas2.0软件分析、对比判断核苷酸、氨基酸差异和变异类型。采用分子亚克隆技术,将长约3.2kb、含ETV耐药变异的HBV全基因克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的ScaI位点,构建pcDNA-HBV3.2质粒。结果:改良的PCR全基因扩增方法成功获得16例ETV耐药CHB患者的3.2kb HBV DNA,样本最低血清HBV DNA含量3.95 log10copies/ml,ETV耐药HBV全基因序列中,除常见RT基因耐药变异外,分别有18.75%(3/16)和31.25%(5/16)的患者发生PreS1和PreS2缺失突变;5例(31.25%)患者PreC区发生第83位核苷酸G→A替换;发现与免疫细胞表位有关的变异11处, S区、RT区重叠变异6处。重组质粒pcDNA-HBV3.2中含有3.2 kb的HBV全长DNA。结论:改良PCR方法可提高HBV全基因组的扩增敏感性,可成功扩增ETV耐药CHB患者外周血全基因组;ETV耐药HBV毒株除在RT区发生耐药变异, S区、C区可发生缺失变异,S、RT区可发生重叠变异;构建的pcDNA-HBV3.2质粒含ETV耐药HBV全基因。