研究目的：本课题基于中医学“以毒攻毒”理论,旨在研究蟾皮有效单体蟾毒灵在体外条件下对肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨线粒体膜电位及线粒体凋亡途径相关蛋白在其中的作用,以初步探讨蟾毒灵抗肺癌的有效分子机制。在抗癌新药飞速发展的今天,为新型天然来源的抗肿瘤中药的进一步研发和以毒攻毒治法的临床运用提供必要的理论和实验依据。研究方法：1.采用CCK-8法检测蟾毒灵对人非小细胞肺癌A549细胞体外增殖的抑制效应,筛选出有效作用剂量范围,并判定量效关系。2. Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测低、中、高浓度组蟾毒灵作用48h下对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响；流式细胞仪分析4ng/mL蟾毒灵作用下对肺癌A549细胞周期的影响。3.倒置显微镜观察各浓度组蟾毒灵作用于肺癌A549细胞48h后对细胞形态学的影响；并以透射电镜观察4ng/mL蟾毒灵作用后A549细胞超微结构的改变及凋亡现象的产生。4.运用JC-1染色探针在荧光显微镜下观察4ng/mL蟾毒灵作用下A549细胞线粒体膜电位的变化情况。5. Western Blot法检测低、中、高浓度组蟾毒灵作用下肺癌A549细胞中与线粒体途径凋亡相关的细胞色素C、Caspase-3蛋白的表达情况；以及加入Caspase抑制剂后各组蛋白表达强度的变化,以探讨线粒体途径参与蟾毒灵诱导肺癌细胞凋亡的分子机制。研究结果：1.不同浓度的蟾毒灵均对肺癌A549细胞表现出明显的生长抑制作用,与对照组比较,具有明显的统计学差异(P<0.01),且给药浓度与抑制效用之间存在良好的依赖性,量效曲线明显。且4ng/mL浓度的蟾毒灵组与顺铂(4pμg/mL)组比较,其OD值未见明显差异(P>0.05),表明体外环境下中药单体蟾毒灵的抗癌活性强,量效性优势明显；同时拟定后续实验中蟾毒灵的最佳作用浓度为4ng/mL2.人肺腺癌A549细胞经过不同浓度的蟾毒灵处理48h后,与正常组相比,各剂量组均导致不同程度的细胞凋亡,差异明显(P<0.05),且总凋亡率及早期凋亡率均呈现出随剂量增高而逐渐增长的趋势；其中,各剂量组组间早期凋亡率相比较,除4ng/mL与8ng/mL比较无统计学意义外(P>0.05),其余均差异明显(P<0.05),表明肺癌细胞凋亡程度与蟾毒灵剂量呈一定比例正相关性,其量效关系良好。同时,当蟾毒灵以4ng/mL浓度作用于肺癌A549细胞48h后,细胞增殖周期中各期所占比例均有不同程度的变化；其中,与正常组比较,仅见两者的S期比例存在显著性差异(P<0.01),表明经蟾毒灵作用后S期比例下降明显,而G1、G2/M期未见明显变化。实验结果提示S期阻滞可能是蟾毒灵抑制肺癌细胞生长的机制之一3.倒置显微镜观察正常对照组A549细胞呈饱满梭性贴壁生长,细胞轮廓清晰、排列紧密,生长状况良好；而各浓度蟾毒灵组均可见细胞数目不同程度的减少,随着给药浓度的增加,A549细胞形态逐渐皱缩变圆并脱壁、细胞密度逐渐减少、细胞间隙逐渐增大、胞浆颗粒逐渐增多,甚至可见较多细胞碎片。上述现象表明经蟾毒灵处理后,肺癌A549细胞生长受到明显的抑制。4ng/mL蟾毒灵作用于人肺癌A549细胞48h后透射电镜下可见细胞体积明显皱缩,细胞表面绒毛较少,核仁消失,染色质固缩凝集,并沿核膜形成数个团块状边集；细胞器如线粒体数量减少、线粒体膜肿胀、线粒体嵴破坏；尚未形成明显的凋亡小体。而正常对照组细胞膜表面光滑完整,可见微绒毛,胞质密度均匀,无空泡,核内染色质分布均匀,核仁完整,居中或边移；细胞器超微结构较清晰、完整。4.荧光显微镜观察染色后细胞,并分别拍摄红色和绿色通道,对照组和实验组均采用相同曝光强度。结果发现实验组和对照组的绿色荧光强度相当,而红色荧光较对照组相对偏弱。与对照组相比,实验组红/绿荧光强度比值下降明显(P<0.05),提示线粒体膜电位去极化程度增加。实验结果表明线粒体膜电位在蟾毒灵诱导肺癌A549细胞凋亡的过程中起着重要的作用。5.经蟾毒灵作用48h后,与对照组相比,肺癌A549细胞中胞浆Cyt C蛋白表达量随给药浓度增加而逐渐上调,而Cyt C蛋白总表达量未见明显变化,由此表明蟾毒灵的促凋亡作用可能与细胞色素C向胞浆内释放的过程密切相关。随着给药浓度的增加,蟾毒灵各组的活化Caspase-3蛋白表达量亦逐渐增强,而蟾毒灵联合Caspase抑制剂的对照组并未引出活化Caspase-3蛋白。因此,可以说明在蟾毒灵的促凋亡机制中,Caspase-3活化是其必不可少的步骤。上述实验可进一步证实,通过诱导线粒体膜内的细胞色素C向胞浆内释放,从而激活Caspase级联反应,最终活化Caspase-3,即线粒体凋亡途径,是蟾毒灵发挥凋亡作用的有效机制之一。研究结论：1.蟾毒灵在体外环境可显著抑制肺癌A549细胞生长,呈明显的剂量依赖性；其机制可能与诱导细胞凋亡及干扰周期有关；2.蟾毒灵可通过诱导肺癌A549细胞早期凋亡抑制细胞增殖,细胞呈现出典型的凋亡早期形态学改变,该效应与剂量在一定范围内呈正相关性；同时,干扰肺癌A549细胞S期合成可能是其作用机制之一；3.蟾毒灵诱导肺癌细胞凋亡的过程呈线粒体依赖性,通过降低线粒体膜电位、影响线粒体功能从而促发早期凋亡；4.线粒体途径的激活是蟾毒灵发挥促凋亡作用的方式之一,分子层面可见该途径相关蛋白如细胞色素C在蟾毒灵作用下向胞浆释放,并顺次启动Caspase家族激活,并由Caspase-3最终执行凋亡。