目的：利用Marmarou大鼠中度创伤性脑损伤（TBI）模型，（1）探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）是否可以向TBI损伤灶中迁移、存活，并促进TBI大鼠的神经功能功能恢复；（2）探讨骨髓间充质干细胞对TBI大鼠治疗作用的机制，包括分泌神经营养因子、向神经组织分化；（3）比较脑内和静脉两种不同移植方法的治疗效果有何不同。方法：1、实验动物及分组：120只SPF级雌性SD大鼠（鼠龄为10周，重约280±20g）被随机分配入4组，包括假手术组（sham group，n=30）；脑创伤模型组（TBI group，n=30）；脑内移植组（intracerebral treatmentgroup，n=30）；静脉移植组（intravenous treatment group，n=30）。骨髓间充质干细胞来自于SPF级雄性SD大鼠（鼠龄为3-4周），应用贴壁筛选法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞，传代、扩增、纯化，传至第3代用于实验。2、模型制备和细胞移植：采用改良Marmarouˊs法建立大鼠中度创伤性脑损伤2周、4周模型。脑内移植组和静脉移植组在伤后1天分别通过侧脑室、尾静脉注入约1×106个细胞，注入的液体量分别为10ul、0.5ml。3、检测指标和方法：分别从每组大鼠中随机取出10只，在伤后1周、2周、3周、4周进行神经功能损伤评分（mNSS）和转棒仪测试。每组中的其余大鼠分别于伤后2周、4周处死，应用苏木素-伊红（HE）染色观察脑组织形态学变化；免疫组织化学方法检测脑组织神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）的表达及分布情况；Western blot法检测脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子的蛋白表达量的情况；激光共聚焦免疫荧光双标技术检测性别决定基因（Sry）、微管相关蛋白2（MAP-2）和神经胶质酸性蛋白（GFAP），观察雄性大鼠BMSCs在雌性TBI大鼠脑组织内的分布及向神经元、星型胶质细胞的分化情况。4、定量测定及统计方法：免疫组化阳性细胞阳性度强弱用Image-ProPlus6.0数码医学图像分析系统半定量分析测定，以积分光度值（IOD）来表示。Western blot蛋白定量分析用Image J图像分析软件分析测定，以目标OD值与内参OD值的比值来表示。实验中所得结果数据均用x s表示，应用SPSS13.0for windows统计软件进行单因素方差分析，以单侧P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1、BMSCs的培养和鉴定：原代贴壁细胞以分散的集簇方式增殖，大约10天后95%原代细胞融合，此时进行传代。传代后细胞通过抑制期，生长迅速，以后每次传代需要4-5天，细胞形态变得更为均一，呈纺锤形，细胞簇呈平行排列生长或漩涡状生长。传到第3代的BMSCs被移植入大鼠体内。通过细胞的生长特性和形态鉴定其为BMSCs。2、形态学检测结果：HE染色光镜下显示假手术组皮层脑组织形态正常，血管管腔正常，管壁光滑，神经细胞数量多，排列规则，结构完整，形态正常；创伤模型组可见不同程度的蛛网膜下腔出血，广泛皮层脑组织水肿，血管腔扩大，毛细血管充血，神经元胞体肿胀，排列紊乱，甚至胞体缩小变形，核固缩浓染；与创伤模型组相比，脑内移植组和静脉移植组脑组织的病理改变均有不同程度的减轻。3、神经运动功能检测结果：假手术组大鼠两项神经运动功能检测均表现正常；与假手术组相比，其余三组造模后所有相同时间点mNSS均升高，转棒仪测试时间明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与创伤模型组相比，两组BMSCs移植组大鼠在所有相同时间点的mNSS均下降，转棒仪测试时间均延长，差异有统计学意义(P<0.05)；与静脉移植组相比，脑内移植组大鼠在2周、3周、4周时的mNSS较低，在第3周时，脑内移植组比静脉移植组转棒仪测试时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。4、NGF免疫组化和Western blot检测结果：NGF免疫组化阳性产物为棕黄色颗粒，定位于胞浆中，阳性细胞形态不规则，广泛分布于检测组织的大脑皮层中。在假手术组神经细胞的胞浆中仅呈弱阳性表达；其余三组大鼠造模后，在所有相同时间点所测阳性结果与假手术组相比，免疫反应增强，阳性细胞数均明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与创伤模型组相比，两组BMSCs移植组大鼠在所有相同时间点所测阳性细胞数均明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与静脉移植组相比，脑内移植组在所有相同时间点所测阳性细胞数均轻度增多，差异有统计学意义(P<0.05)。NGF为分子量32kD的蛋白。与NGF的免疫组化检测结果相似，假手术组仅有少量NGF表达，且蛋白表达量在两时间点无变化；脑创伤模型组和两组BMSCs移植组NGF动态表达与免疫组织化学在各个时间点检测结果相吻合，比较同免疫组化检测，差异同样有统计学意义(P<0.05)；与静脉移植组相比，脑内移植组在所有相同时间点所测蛋白表达量均轻度增多，差异有统计学意义(P<0.05)。5、BDNF免疫组化和Western blot检测结果：BDNF免疫组化阳性产物和NGF相似，同样为定位于细胞胞浆中的棕黄色颗粒，阳性细胞呈圆形或椭圆形，广泛分布于检测组织的大脑皮层中。BDNF蛋白在假手术组神经细胞的胞浆中仅微量表达，免疫反应性同样不随时间而发生变化；其余三组大鼠造模后，在所有相同时间点所测阳性结果与假手术组相比，免疫反应增强，阳性细胞数均明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与创伤模型组相比，两组BMSCs移植组大鼠在所有相同时间点所测阳性细胞数均明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与静脉移植组相比，脑内移植组仅在2周时所测阳性细胞数轻度增多，差异有统计学意义(P<0.05)。BDNF为分子量27-34kD的蛋白。平均光密度分析发现，假手术组仅有微量BDNF表达，且蛋白表达量在两时间点无变化；同样，脑创伤模型组和两组BMSCs移植组BDNF动态表达与免疫组织化学在各个时间点检测结果相吻合，比较同免疫组化检测，差异也有统计学意义(P<0.05)；不同于免疫组化检测结果的是，与静脉移植组的比较中，脑内移植组在所有相同时间点BDNF蛋白表达量均轻度增多，差异有统计学意义(P<0.05)。6、免疫荧光双标染色结果Sry阳性细胞胞核为FITC标记的绿色荧光，MAP-2和GFAP阳性细胞胞浆为TRITC标记的红色荧光。假手术组和脑创伤模型组各个时间点均未见绿染的或红染的阳性细胞；在两细胞移植组各个时间点大鼠脑切片中，均可见绿染的Sry与红染的MAP-2共定位，及绿染的Sry与红染的GFAP共定位；与同组2周脑切片相比，脑内移植组和静脉移植组4周的脑切片中绿染的Sry阳性细胞明显减少，仍可见与红染的MAP2和GFAP共定位；脑内移植组各个时间点绿染的Sry阳性细胞数明显比静脉移植组多；在脑内移植组4周脑切片中，可看到单独存在红染的MAP2阳性细胞，无绿染的Sry与其共定位；静脉移植组4周脑切片可观察到单独存在红染的GFAP阳性细胞，无绿染的Sry与其共定位;在静脉移植组4周脑切片中，脑实质和血管腔里仍可看到单独绿染Sry而无分化红染共定位的BMSCs阳性细胞。结论:1、通过侧脑室和尾静脉两种途径移植BMSCs治疗大鼠创伤性脑损伤， BMSCs均可迁移入损伤灶内，至少存活4周，可分化成为神经元和星型胶质细胞，并促进TBI大鼠的神经功能恢复。2、 BMSCs对TBI大鼠起治疗作用的机制可能是：自分泌和旁分泌神经营养因子NGF、BDNF；自身分化成为神经元和星形胶质细胞；促进内源性前体细胞分化为神经元和星型胶质细胞。3、从神经功能恢复，神经营养因子分泌量和向神经细胞分化这三方面看，相对于尾静脉移植，侧脑室移植BMSCs对TBI大鼠治疗作用更强。