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人组织激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin,Kal),作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,在炎症反应、血管生成以及损伤修复等多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。本课题组前期研究表明,Kal具有良好的抗肝纤维化的作用,可以抑制大鼠肝星状细胞的活化,下调星状细胞中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,并且抑制H202诱导的星状细胞活性氧的形成。同时发现Kal可以作为肝纤维化诊断指标来对肝脏健康状况进行有效检测,并申报国家专利。本研究是在Kal确定可以作为肝纤维化诊断试剂研发基础上的自然延伸,旨在创建一个以Kallistatin为指标的肝纤维化分子诊断ELISA试剂盒。本研究根据国家卫生部关于临床诊断试剂盒制作标准来设计、推进。即当前临床上所用试剂盒除了对抗体进行检测外的试剂盒均为是使用双抗体夹心法,在检测抗体上加入生物素-链霉亲合素系统。本研究首先采用毕赤酵母发酵法和哺乳动物表达获取Kal蛋白。实验结果显示:毕赤酵母表达的Kal蛋白糖基化水平不足,与天然的蛋白质有一定的差异,无法采用。故本研究采用酵母发酵和哺乳动物表达系统获得的Kal蛋白进一步探索。本研究结果显示:通过酵母发酵可获得较高纯度的重组Kal蛋白,使用该蛋白制作抗体时,发现其Kal蛋白免疫原性较差,所以进行免疫时使用40μg/mL的Kal与弗氏佐剂1:1混合后,免疫效果呈现最佳效果。使用脾内免疫与皮下免疫方法对比后发现皮下免疫虽然时间较长,但是效价较高,适合作为单克隆抗体制作的方法。在此基础上,本研究还构建了Kal哺乳动物表达载体,并使用该载体探索在CHO细胞里高效表达,同时进行条件优化。这对于制作一个高灵敏度临床应用的肝纤维化Kal诊断试剂盒提供了参考依据,为临床应用Kal-ELISA试剂盒提供前期基础。