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目的:构建含有四环素(Tetracycline,Tet)诱导调控降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达的重组腺相关病毒质粒,并包装9型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated viral vector9,rAAV9),将其体外转染原代心肌细胞,观察重组腺相关病毒介导CGRP基因在原代心肌细胞中的表达。方法:1.pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒的构建以pAAV-TRE-CMV-tTS/rtTA为模版,PCR扩增并插入双酶切(Ba-mHI、ApaLI)和引入Myc尾的CGRP-Myc片段,再将双酶切后的片段连接构成重组腺相关病毒质粒pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA。2.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒的包装与鉴定将pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒与pAA-V9包装质粒、辅助质粒pHelper共同转染HEK293细胞,获得rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。用SDS-PAGE测定病毒纯度和q-PCR法测定病毒滴度。3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒表达的检测将重组腺相关病毒rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA体外转染乳鼠原代心肌细胞,并在细胞培养液中加入Dox诱导CGRP表达,提取mRNA和蛋白质,用RT-PCR法和WesternBlot法测定CGRP基因的表达水平。结果:1.成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒。2.成功包装rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒,病毒滴度为 1.87×1012GC/mL。3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞,并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。结论:成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒,并包装和鉴定rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。