论文部分内容阅读
花生是八大类致敏食物之一,其造成的过敏症状严重,发生率较高,而且不随过敏患者年龄的增长而消减,引起了社会的广泛关注。在目前已发现的13种花生过敏蛋白中,Ara h2蛋白占花生总蛋白含量的10%左右,能够被90%花生过敏患者血清识别,是花生的主要过敏原之一。过敏原蛋白的分离提取为其致敏研究所必须,故其纯化方法的建立具有重要的研究价值。本论文以Ara h2为研究对象,通过获取相应抗体,进行免疫亲和层析柱制备,并将自制柱应用于生花生及加工花生产物中Ara h2的纯化。论文的研究工作包括利用天然花生Ara h2制备兔抗Ara h2多克隆抗体并分离;Ara h2免疫亲和层析柱的制备;热加工花生蛋白产物中Ara h2纯化。研究的主要方法、结果及结论如下:1.采用离子交换层析法从天然花生中分离Ara h2,并通过SDS-PAGE对分离蛋白纯度进行鉴定;利用分离得到的高纯度的Ara h2作为免疫原,采用多点皮下注射免疫日本大耳白兔,获得抗Ara h2的兔多克隆抗体,并通过ELISA和免疫印迹方法检测其效价和特异性;以分离得到的高纯度的Ara h2和溴化氢活化的sepharose-4B柱材作为亲和介质材料,制备了从兔抗Ara h2血清中分离纯化抗Ara h2多克隆抗体的亲和层析柱,并利用SDS-PAGE和werstern blot进行鉴定。结果显示:纯化得到的天然Ara h2纯度高达90%以上,其多克隆抗体效价高,特异性强。同时制备得到抗Ara h2多克隆抗体的亲和层析柱偶联率95.1%,抗体/柱材结合比率为17.1mg/g。SDS-PAGE结果表明通过该层析柱子分离得到的抗花生过敏原Ara h2特异性抗体纯度高;免疫印迹法鉴定表明该抗体特异性非常高,ELISA检测效价为1:6400,相对于上样血清,抗体被富集了100倍以上。2.利用纯化得到的抗Ara h2多克隆抗体与溴化氢活化的sepharose-4B柱材相偶联制备了用于分离Ara h2蛋白免疫亲和层析柱,并对该自制柱偶联率、柱容量、回收率、使用次数等参数进行了表征。结果显示:该Ara h2蛋白免疫亲和层析柱偶联率为90.4%,抗体的介质密度为18.1mg/g,该自制柱柱容量约0.55-0.60mg,Ara h2回收率在92.7%-97.8%之间,在使用11次后其柱容量仍保持原柱容量的87.5%,说明自制柱具有优良的重复使用性能。3.以生花生粗蛋白液为基本样品分别进行水煮15、30、45、60、90min加工处理,之后对两种样品进行15min、30min、45min、60min、90min体外模拟胃消化和5min、15min、30min、60min、90min体外模拟胃肠消化。以Gly-HCl(p H2.7)作为洗脱液,利用自制Ara h2蛋白免疫亲和层析柱对生花生、水煮花生、胃消化、肠消化产物中Ara h2蛋白进行分离,并通过SDS-PAGE和werstern blot对分离产物进行鉴定,利用ELISA方法分别测定生花生、水煮花生胃消化、肠消化产物中Ara h2的提取率。结果显示:水煮处理造成了花生粗蛋白复杂聚集,不同的水煮时间形成的电泳条带差异不显著,尤其是Ara h2蛋白带;体外模拟胃消化使生花生和水煮花生蛋白粗提液发生不同程度消化,Ara h2蛋白具有较强抗胃液消化;在体外模拟胃肠消化中生花生和水煮花生蛋白粗提液中的蛋白质都被消化降解,Ara h2蛋白消化也很明显。利用自制Ara h2蛋白免疫亲和层析柱从生花生、水煮花生胃消化、肠消化产物成功分离出Ara h2蛋白,SDS-PAGE结果显示生花生粗提液样品蛋白纯度为87.4%,水煮花生粗提液分离产物中Ara h2纯度为79.5%,二者体外模拟消化产物分离产物纯度分别为72.7%和70.7%左右,并且层析柱能够分离获得水煮加工形成Ara h2蛋白二聚体。ELISA结果显示生花生、水煮花生胃消化、肠消化产物提取率分别为94.4%、88.7%、73.4%、79.2%,说明自制Ara h2蛋白免疫亲和层析柱对该蛋白有较好分离能力。