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背景慢性疼痛(Chronic pain),尤其是外周神经损伤后导致的顽固、剧烈的神经病理性疼痛(neuropathic pain)尚无有效的治疗方法。脊髓背角N一甲基一D一天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NR)在痛敏的产生和维持方面起关键作用,而NMDA受体2B (NMDA receptor2B,NR2B)亚基是NR参与疼痛调节的主要亚基,其过度表达在神经病理性疼痛的产生和维持方面起关键作用。现有的抑制NR2B的方法,如NR拮抗剂、NR2B单克隆抗体等,存在着各种各样的缺陷。近年来,利用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)抑制NR2B的表达是神经病理性疼痛甚至神经损伤治疗的研究热点。如何安全、高效的将siRNA运载至细胞,合适的载体是关键。目前,作为治疗用的病毒及非病毒载体存在一定缺陷。最近,一种新型非病毒载体,由低分子量聚乙烯亚胺(poly-ethylenimine,PEI)和胆固醇组成的水溶性脂质体(water-soluble lipopolymer,WSLP)被认为具有无毒且转染效率高的特点。Kim等认为,WSLP还可透过血脑屏障,具有中枢靶向性。因此,我们推测,WSLP有可能高效运载NR2B-siRNA,抑制脊髓背角NR2B的表达,从而治疗慢性疼痛。我们在前期的实验中也证实,通过鞘内注射的途径,WSLP可以运载NR2B-siRNA,抑制脊髓NR2B的表达,抑制神经病理性疼痛大鼠的痛觉过敏。由于鞘内注射途径操作复杂,有可能导致神经损伤,而WSLP包裹的NR2B可避免血液中酶对核苷酸的破坏,可透过血脑屏障,因此,通过更为简单的注射方法如血液途径(大鼠通常通过腹腔注射),WSLP也可能有效运载NR2B,抑制SCDH NR2B的表达,进而抑制神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏,治疗慢性疼痛。为此,本研究在前期将WSLP与NR2B-siRNA成功连接形成WSLP/NR2B-siRNA纳米复合物的基础上,观察腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA对神经病理性疼痛大鼠SCDH NR2B转录水平及蛋白水平基因表达的影响,然后观察腹腔注射此复合物后神经病理性疼痛大鼠50%机械性撤足阈值及热刺激撤足潜伏期的变化,以探讨腹腔注射此复合物对大鼠神经病理性疼痛的治疗作用。目的探讨通过腹腔注射的途径(血液途径),WSLP运载NR2B-siRNA沉默大鼠脊髓NR2B表达,进而治疗神经病理性疼痛的可行性,为慢性疼痛的基因治疗提供新思路、新手段。方法研究过程分两部分进行：1.WSLP运载siRNA沉默神经病理性疼痛大鼠脊髓NR2B的可行性的实验研究。按照前期研究合成WSLP/NR2B-siRNA,NR2B-siRNA由广州锐博公司合成。取SD大鼠28只,采用完全随机分组,将大鼠分为对照组和神经病理性疼痛治疗组。其中对照组又分为：空白对照组(blank control group,C组)：不给予任何处理(n=4)；神经病理性疼痛模型组(neuropathic pain model group,NP组)：L5脊神经结扎切断+腹腔注射生理盐水(n=4)；假手术组(sham operation group,sham组)：L5脊神经暴露但不结扎(n--4)。神经病理性疼痛治疗组又分为：WSLP/NR2B-siRNA组(WSLP/NR2B-siRNA group,siWSLP):L5脊神经结扎切断+腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA(n=4);PEI/NR2B-siRNA组(PEI/NR2B-siRNA group,PEI组)：L5脊神经结扎切断+腹腔注射PEI/NR2B-siRNA(n=4); WSLP/阴性对照siRNA组(WSLP/negative control siRNA group,ncWSLP组)：L5脊神经结扎切断+腹腔注射WSLP/阴性对照siRNA(n=4);WSLP组(WSLPgroup,WSLP组)：L5脊神经结扎切断+腹腔注射WSLP(n=4)。神经病理性疼痛模型采用经典L5脊神经结扎大鼠模型稍作改良。治疗组大鼠于神经病理性疼痛模型制作后第8天上午单次腹腔注射相应复合物,其中siRNA(ncRNA)的量为10nmol。腹腔注射后第3天冰面上摘取L4-L6节段脊髓,均分为两份,存放于液氮中。①取各组脊髓标本,提取总RNA,采用荧光定量Q-PCR方法,检测各组大鼠脊髓中NR2B mRNA表达变化。②取各组脊髓标本,采用western-blot的方法,检测各组大鼠脊髓NR2B蛋白表达的变化。2.腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA后神经病理性疼痛大鼠50%机械性撤足阈值及热刺激撤足潜伏期的变化。参照一期实验,将42只SD大鼠随机分为对照组和神经病理性疼痛治疗组。其中对照组又分为：C组(n=6),NP组(n=6)以及sham组(n=6)；神经病理性疼痛治疗组又分为：PEI组(n=6),siWSLP组(n=6),WSLP组(n=6)以及ncWSLP组(n=6)。神经病理性疼痛模型采用经典L5脊神经结扎大鼠模型稍作改良。治疗组大鼠于神经病理性疼痛模型制作后第8天上午单次腹腔注射相应复合物,其中siRNA(ncRNA)的量为10nmol。于造模前1d、造模后7d及腹腔注射后3d、7d、14d、21d,用Von Frey hair触觉测量套件测定各组大鼠50%机械性撤足阈值(g);用热辐射足底测试仪测定各组大鼠热刺激撤足潜伏期(s),所有监测均在安静环境下09：00至18：00进行。通过上述检测阈值的变化判定腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA对神经病理性疼痛大鼠的治疗作用。结果1.水溶性脂质体运载NR2B-siRNA对神经病理性痛大鼠脊髓NR2B表达的影响。结果如下：①荧光定量Q-PCR检测结果：与空白对照组(0.999998±0.280975)比较,神经病理性疼痛模型组(2.205743±0.179487)、PEI/NR2B-siRNA组(2.050804±0.177607),WSLP/NR2B-siRNA组(1.357595±0.209369),WSLP/阴性对照siRNA组(2.234429±0.281335),WSLP组(2.185523±0.262402)以及假手术组(1.259142±0.166204)脊髓背角NR2B mRNA水平显著增加(P<0.01)；与神经病理性疼痛模型组(2.205743±0.179487)比较,WSLP/NR2B-siRNA治疗组(1.357595±0.209369) NR2B mRNA显著下降38.45%(P<0.01),而PEI/NR2B-siRNA组(2.050804±0.177607；P=0.056728791)、WSLP/阴性对照siRNA组(2.234429±0.281335；P=0.722029158)及WSLP组(2.185523±0.262402；P=0.801975223)脊髓NR2B mRNA水平无统计学差异(P>0.05)；与假手术sham组(1.259142±0.166204)比较,WSLP/NR2B-siRNA组(1.357595±0.209369)脊髓NR2B mRNA的表达水平较假手术组无统计学差异(P>0.05)。②Western-Blot检测结果：腹腔注射后第三天,与C组(0.220479±0.020437)相比,NP组(0.599576±0.019125),PEI组(0.619809±0.026794),siWSL组(0.335245±0.026887),ncWSLP组(0.626820±0.025939),以及WSLP组(0.600177±0.032491)脊髓NR2B蛋白表达水平显著增高(P<0.01)。与NP组(0.599576±0.019125)相比,siWSLP组(0.335245±0.026887)脊髓NR2B蛋白表达水平显著降低44.09%(P<0.01)。PEI组(0.619809±0.026794；P=0.274410),：ncWSLP组(0.626820±0.025939；P=0.145653)以及WSLP组(0.600177±0.032491；P=0.973749)较NP组(0.599576±0.019125)无统计学差异(P>0.05)。2.腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA后神经病理性疼痛大鼠50%机械性撤足阈值及热刺激撤足潜伏期的变化。在神经病理性疼痛模型形成并稳定后,各组大鼠患足的50%机械性撤足阈值和热刺激撤足潜伏期较其造模前基础阈值均显著下降(P<0.05)。腹腔注射后第3天,WSLP/NR2B-siRNA组大鼠患足50%机械性撤足阈(9.13±1.05g)和热刺激撤足潜伏期(9.87±0.42s)明显增高,较其腹腔注射前(1.98±0.14g;5.04±0.30s)相比有统计学差异(P<0.05),而神经病理性疼痛模型组、PEI/NR2B-siRNA组、WSLP/阴性对照siRNA组及WSLP组腹腔注射后第三天大鼠患足50%机械性撤足阈值和热刺激撤足潜伏期较其腹腔注射前无明显变化(P>0.05)。各组大鼠组间比较结果显示：腹腔注射后第3天,WSLP/NR2B-siRNA组大鼠患足50%机械性撤足阂值(9.13±1.05g)和热刺激撤足潜伏期(9.87±0.42s)较神经病理性疼痛模型组(2.16±0.30g;5.09±0.34s)相比有显著差异(P<0.01),而PEI/NR2B-siRNA组、WSLP/阴性对照siRNA组以及WSLP组50%机械性撤足阈值(PEI组：3.33±0.91g；ncWSLP组：1.95±0.73g;WSLP组：1.97±0.32g)和热刺激撤足潜伏期(PEI组：5.58±0.54s;ncWSLP组：4.90±0.31s;WSLP组：5.22±0.26s)较神经病理性疼痛模型组(2.16±0.30g;5.09±0.34s)无统计学差异(P>0.05)。与假手术组相比,腹腔注射后第3天：PEI/NR2B-siRNA组大鼠患足50%机械性撤足阈值(3.33±0.91g)和热刺激撤足潜伏期(5.58±0.54s)均值较假手术组(9.12±1.1lg；10.08±0.43s)低,且差值有统计学意义(P<0.01,)；而WSLP/NR2B-siRNA组患足50%机械性撤足阈值(9.13±1.05g)和热刺激撤足潜伏期(9.87±0.42s)与假手术组比较无统计学差异(P>0.05)。腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA使神经病理性疼痛模型大鼠患足50%机械性撤足阈值和热刺激撤足潜伏期显著增高,且这种变化趋势持续至腹腔注射后7d。结论1.神经病理性疼痛大鼠SCDH NR2B mRNA水平及蛋白水平的表达显著升高；腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA复合物,可明显抑制神经病理性疼痛大鼠脊髓NR2B mRNA水平及蛋白水平的升高；说明通过腹腔注射途径,WSLP可运载NR2B-siRNA抑制神经病理性疼痛大鼠NR2B的过度表达。2.神经病理性疼痛大鼠患足50%机械性撤足阈值和热刺激撤足潜伏期均明显降低；腹腔注射WSLP/NR2B-siRNA复合物,可显著抑制神经病理性疼痛大鼠患足的50%机械性撤足阈值和热刺激撤足潜伏期的降低；说明通过腹腔注射途径,WSLP可运载NR2B-siRNA抑制神经病理性疼痛大鼠的痛觉过敏,因而对神经病理性疼痛具有治疗作用。3.上述结果表明：通过腹腔注射途径,WSLP可运载NR2B-siRNA抑制神经病理性疼痛大鼠NR2B的过度表达,从而对神经病理性疼痛具有治疗作用。