从无脊椎动物到哺乳动物都存在着色素沉积过程。动物的色素沉积除了实现稀有和美丽的体色外,还具有诸多功能,包括伪装、体温调节、交配选择、个体交流、抗干燥、盐度适应以及免疫等,这些作用使得体色成为生物生存及繁殖相关的重要表型特征。此外,色素沉积过程也为理解进化生物学中的其他关键问题,如适应、物种形成及平衡多态性的维持等,提供了与之相关并且具体可见的表型特征。棘皮动物体色多样,甚至在物种内体色也有巨大差异,而有关棘皮动物色素及色素沉积的研究125多年前就开始了,至今依然是研究热点之一。另外,棘皮动物属于后口动物,其临近分类物种包括脊索动物,因此,相对于其他无脊椎动物,棘皮动物许多参与发育、再生和色素形成的基因与哺乳动物的关系更密切。刺参作为棘皮动物之一,具有多种体色和重要的营养、医药价值,在亚洲许多国家和地区被认为是最具价值的海洋商业物种。目前青刺参较为普遍,紫刺参和白刺参数量很少且更受消费者青睐。然而,迄今为止,对于刺参体色形成的分子和遗传机制知之甚少,甚至在棘皮动物中亦是如此。本研究通过Illumina转录组、IBT蛋白组、LC-QTOF-MS代谢组、Ch IP-seq、Real time PCR、原位杂交、免疫组化和遗传育种等技术来揭示刺参体色形成的分子和遗传机制。主要研究结果如下:1.刺参色素种类、含量及黑色素细胞比较研究在本项研究中,对白刺参、浅青刺参、深青刺参及紫刺参四种色型刺参体壁进行了色素种类、含量及黑色素细胞比较研究。色素种类及含量比较实验结果表明:白刺参的色素种类远远少于其他颜色刺参;除白刺参外,浅青、深青、紫刺参中都存在黑色素、虾青素、β-胡萝卜素和叶黄素这些生物色;黑色素对于刺参体色的形成起到最主要作用;结构色鸟嘌呤在所有色型刺参中都是最高的。TEM(透射电子显微镜)黑色素细胞比较分析实验结果表明:白刺参中黑色素细胞数量最少且不存在成熟的黑色素小体;随着刺参色型颜色加深,其黑色素颗粒数量越多;深青刺参和紫刺参中除了存在成熟黑色素小体,还有黑色素颗粒分泌到细胞外。2.刺参体色发生各阶段生长生理特性比较研究在本项研究中,从生长、组织、细胞三个层面系统描述了不同色型刺参不同体色发生阶段的具体差异。在生长生理方面,无论是体色发生率还是生长率都是紫刺参高于青刺参高于白刺参。组织结构方面,不同色型刺参体色发生三阶段的体壁结构比较研究表明,体壁表皮层厚度和黑色素细胞密度皆为紫刺参高于青刺参高于白刺参。色素细胞方面,TEM实验研究表明,紫刺参成熟黑色素小体数量最多,体色发生后阶段出现黑色素颗粒分泌。表皮层厚度和黑色素含量可能是导致三种色型刺参之间生长和存活率差异的新发现因素。3.刺参体色发生三阶段转录组分析在本项研究中,通过Illumina测序,对白、青、紫刺参体色发生的三阶段进行了基因表达动态变化趋势分析,并筛选出与白化、色素沉积、体色多态性相关的差异表达基因,为系统解析刺参体色发生及白化的分子调控机制奠定了基础。但令人意外的是,无论是本项研究中获得的刺参转录组数据还是刺参基因组数据,以及海胆基因组、转录组中,都未发现酪氨酸酶基因,而酪氨酸酶是黑色素形成通路中最为关键的酶,它将酪氨酸转化为DOPA。因此推测刺参乃至棘皮动物黑色素合成路径中的酪氨酸酶功能可能由其他基因编码的酶取代,或者酪氨酸酶基因序列在某些分类单元中是高度不保守的,同时也不排除黑色素有外源摄取的可能。4.紫刺参体色发生三阶段蛋白组分析在本项研究中,首次使用IBT蛋白质组测序技术来揭示紫刺参体壁色素沉积的分子机制。通过对紫刺参体色发生前、体色发生时、体色发生后三个阶段进行蛋白质组分析,共鉴定出5580个蛋白,其中,紫刺参体色发生时阶段相对于体色发生前阶段有1099个差异蛋白,体色发生后阶段相对于体色发生时阶段中有339个差异蛋白。GO和KEGG分析表明,“黑色素合成”,“黑色素小体”,“黑素瘤”,“色素生物合成过程”,“表皮发育”,“Ras信号通路”,“Wnt信号通路”的相关差异蛋白可能涉及到紫刺参色素合成和调控。该项研究鉴定出的差异蛋白对于揭示刺参色素沉积机制具有重要作用,并且为今后研究刺参抗黑素瘤、白化、UV损伤及其他疾病奠定了基础。5.刺参体色发生阶段代谢组分析在本项研究中,利用UHPLC-QTOF/MS技术对处于体色发生时阶段的白刺参、青刺参、紫刺参进行了代谢组分析,共鉴定出2633种代谢物,筛选出了参与色素沉积、体色形成过程的潜在差异显著代谢物,为阐明刺参代谢过程和体色发生的相关机制奠定了基础。6.MITF基因在白、青、紫刺参中的差异研究MITF基因是黑色素细胞发育以及黑色素合成通路中最关键的基因之一。本项研究涵盖原位杂交、免疫组化、Ch IP-seq、real time PCR、Western Blot、以及多态性等实验。其中,real time PCR实验表明,MITF m RNA的表达量在紫刺参最高,白刺参最低;Western Blot实验表明,MITF蛋白的表达量在紫刺参最高,白刺参最低;免疫组化实验表明,MITF蛋白主要在表皮层表达;原位杂交实验表明,MITF基因主要在表皮层表达;多态性实验表明,1-9号外显子中,共存在20个SNP位点,其中两个位点是非同义突变,其余的是同义突变。Ch IP-seq实验筛选出了MITF可能结合的DNA序列。该项研究全面阐释了MITF基因在不同颜色刺参中的表达情况,并筛选出了与体色相关的SNP,后续将在良种选育中进行应用。7.刺参杂交、自交家系子代分析在本项研究中,采用完全双列杂交设计,构建了九个家系。研究结果表明,除白刺参外,自交家系子代与亲代体色一致,杂交子代体色多数与亲代母本体色一致,杂交子代相对于自交子代生长更为快速。根据本研究结果推断,野生白刺参体色遗传不稳定,需要不断选育;紫刺参体色遗传稳定且个体间体色差异极小,是研究刺参体色遗传的理想材料;刺参生长可能存在杂交优势,可通过不同杂交家系获得优势组合;刺参体色遗传受母系性状影响。