论文部分内容阅读
目的心脏移植是临床治疗终末期心功能衰竭的唯一有效手段,但术后急、慢性排斥反应严重制约着该技术的广泛推广应用。研究诱导免疫耐受方案意义重大。母胎免疫耐受是天然的同种异体免疫耐受模型。位于母胎界面的绒毛膜组织不表达经典的HLAⅠ类分子而表达非经典HLAⅠ分子(包括HLA-G等)是母胎耐受的重要机制之一。本研究通过提取小鼠母胎界面的特异性的H2Bl基因,构建pEGFP-N1-H2B1质粒载体,并转染至小鼠血管内皮细胞,观察pEGFP-N1-H2B1质粒载体转染对小鼠血管内皮细胞增殖和凋亡的影响,探讨利用母胎免疫耐受介导术后移植排斥反应的机制。方法本研究分为两部分:第一部分双酶切技术和基因测序对重组pEGFP-N1-H2B1质粒载体进行鉴定;第二部分转染pEGFP-N1-H2B1至小鼠血管内皮细胞,观察pEGFP-N1-H2B1质粒载体转染对小鼠血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。pEGFP-N1-H2B1质粒载体构建过程中,首先在小鼠胎盘提取总RNA,PCR扩增H2Bl基因;然后用内切酶EcoRI和BamHI双酶切将PCR产物连接至T载体,并进行基因测序;最后利用内切酶EcoRI和BamHI对重组TS-H2B1和pEGFP-N1进行双酶切,将H2B1亚克隆至pEGFP-N1,并利用内切酶XhoI、BamHI双酶切法进行鉴定。转染pEGFP-N1-H2B1质粒载体于小鼠血管内皮细胞,并对小鼠血管内皮细胞进行倒置显微镜下观察、生长曲线绘制以及免疫组织化学进行鉴定。实验分为空白对照组和实验组,分别以不同浓度的pEGFP-N1-H2B1质粒载体进行干预:细胞刺激生长实验分别以2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL干预小鼠血管内皮细胞,细胞计数观察1-6天小鼠血管内皮细胞的变化;MTT检测小鼠血管内皮细胞增殖情况,分别以2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL干预小鼠血管内皮细胞,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞调亡,分别以2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL干预小鼠血管内皮细胞,转染后24 h、48 h、72 h处理细胞,观察随时间变化细胞凋亡情况,并绘制曲线。结果pEGFP-N1-H2B1质粒载体构建过程中,1%琼脂糖凝胶中电泳对PCR产物进行检测,观察到在1070 bp处有一条亮带,于H2bl基因的分子量相对应;1%琼脂糖凝胶中电泳对TS-H2B1载体的鉴定,观察到三个克隆片段均在1070 bp处有一条亮带,证明三个克隆片段均为正确克隆;基因测序显示只有两个碱基突变;XhoI、BamHI双酶切法对pEGFP-N1-H2B1质粒载体的鉴定,观察到两个克隆片段均在1070 bp处有一条亮带,证明两个克隆片段均为正确克隆。倒置显微镜观察小鼠血管内皮细胞生长情况,培养48h后,可见大部分贴壁细胞连接形成网状,细胞密度较低;3-5d后,内皮细胞岛出现;约7-9d后细胞融合成片,细胞呈单层镶嵌状排列,呈现“鹅卵石样”或“铺路石样”,出现接触抑制现象。兔抗鼠抗Ⅷ抗体和荧光素标记抗体鉴定结果显示清晰的血管内皮细胞核。转染pEGFP-N1-H2B1质粒载体于小鼠血管内皮细胞,细胞刺激生长实验显示随着pEGFP-N1-H2B1质粒载体浓度的增大和时间的延长对细胞生长产生抑制作用;MTT检测显示空白对照组和实验各组之间均有差异,具有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡显示空白对照组和实验各组之间均有差异,具有统计学意义(P<0.05)。结论pEGFP-N1-H2B1重组质粒载体构建成功。小鼠血管内皮细胞体外培养成功。pEGFP-N1-H2B1重组质粒载体转染小鼠血管内皮细胞抑制小鼠血管内皮细胞的增殖,促进细胞凋亡。