背景真菌性角膜炎（Fungal keratitis,FK）是一类由真菌感染而引发机体角膜组织发生炎症反应性疾病。本病是由Leber于1878年首次报道,是一类常见的、较顽固的真菌感染。由于本病早期诊断及治疗困难,常导致患者角膜溃疡或穿孔,进展为眼内炎,引发视力障碍或失明。近年来,由于在临床上大量使用抗生素、皮质类激素、免疫抑制剂等药物,我国真菌性角膜炎在人群中发病率呈逐年增高趋势,以男性及农村居民感染为主,继白内障之后成为首要致盲性眼病^[1],给人们家庭及社会发展造成巨大的经济负担。镰刀菌和曲霉毒是引起眼部真菌感染的主要菌种,而曲霉菌引起的眼感染症中主要是由感染烟曲霉菌和黄曲霉菌所致。在一些地区真菌角膜感染已经成为主要的致病原^[2]。目前,临床上真菌感染的患者很多,然而治疗真菌性角膜炎的有效药物却很少,并且治疗比较困难。因此,深入研究本病的病原学、病理学、免疫学、诊断学和流行病学,对本病的早期诊断和防治有着重要的意义。角膜呈球冠型,中央薄,边缘厚,自外向内由5层角膜细胞和结缔组织所构成,其机械屏障可以抵御真菌的感染。角膜上皮细胞及基质细胞也可以通过表达一些模式识别受体（PRRs）,通过病原相关分子模式（PAMPs）激活人体的固有免疫,诱导特异的适应性免疫应答,以清除病原体^[3],修复病原对人体的损害。Ariizumi等人于2000年首次发现树突状细胞相关C型凝集素-l（Dentritk cell associated C Type lectin-1,Dectin-1）^[4],后者是树突状细胞表面特异性表达的受体,并且广泛分布于树突状细胞、单核细胞、B细胞以及部分T细胞亚群等。同时,在鼠神经胶质细胞上亦有表达^[5]。最近有研究表明,Dectin-l能够识别真菌、细菌表面的β-1、3/β-1、6-葡聚糖和碳水化合物。在真菌感染过程中,Dectin-l参与Th17细胞的产生,后者能够分泌产生IL-6、IL-17A、TNF-ɑ和IL-17F等细胞因子,这些细胞因子可以动员、募集及活化中性粒细胞,对抗细胞外真菌及细菌感染的免疫反应。Th17细胞产生的IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程,从而有效地诱导组织的炎症反应。由于Tyr238X突变使得Dectin-l不能在细胞膜上表达,减少了IL-17的产生,增加了真菌感染的易感性^[6][7][8]。而IL-12和TNF-α因子在抗真菌感染反应中也发挥重要的作用。Dectin-1受体是一类跨膜结构,属于C型凝集素受体家族中的一员,其能够识别外源性病原菌,例如真菌和分歧杆菌等,也能够识别T细胞表达的内源性配体。由于这一受体能够识别真菌,因此在真菌性角膜炎患者体内能够被发现。而在对患者实施临床诊断和治疗时,也可通过干预Dectin-1受体作用而达到良好的效果。但需注意的是,当前我国在对真菌性角膜炎患者的临床诊治研究中,对Dectin-1受体已有一些研究,但需要更深入的探讨,正是据此本文开展这方面的研究。目的本文拟探讨真菌性角膜炎动物模型建立后大鼠角膜的病理变化,Dectin-1受体的表达水平,以及Dectin-1受体与IL-17、IL-12和TNF-α等多种细胞因子之间的关系,以期揭示Dectin-1受体在抗真菌性角膜炎免疫应答中的作用和机制,为临床上诊治真菌性角膜炎,寻找新的治疗靶点提供进一步的实验依据。方法一、动物模型建立1.实验动物与分组选取由大连医科大学实验动物中心提供的60只Wistar清洁级、健康大鼠,雌雄不限、8周龄,体重在200g-250g之间,经裂隙灯显微镜检测后眼部角膜组织均没有结构和功能病变。将这些大鼠分为三组:实验组1、实验组2和对照组,每组分别为25只、25只和10只。2.模型建立（1）采用中国普通微生物菌种保藏管理中心提供的烟曲霉菌菌株（编号为3.0772）,制备成浓度为1×10⁸个菌丝/毫升的菌悬液。（2）分别测定实验大鼠的眼部角膜曲率半径,计算平均值作为最终值,将封口膜制备成相应曲率半径的角膜接触镜,并使用浓度为75%的乙醇进行浸泡消毒。（3）实验组1的25只大鼠眼部给予Dectin-1特异性抑制剂昆布多糖（Laminarin）处理;实验组2的25只大鼠眼部给予生理盐水处理,不使用昆布多糖（Laminarin）。（4）实验组1和实验组2的50只大鼠,均在角膜中部区域钻大约2mm的圆形印痕。（5）将菌悬液滴在实验组1和实验组2大鼠的角膜上,用制备好的角膜接触镜进行覆盖,缝合眼睑,保证大鼠感染目标菌株,建立真菌性角膜炎大鼠动物模型。二、实验方法在建立真菌性角膜炎动物模型后,在第1天、第2天、第3天和第5天,分别取对照组、实验组1、实验组2的大鼠角膜上皮组织。1.HE染色后进行病理学观察;2.采用免疫组化法检测各组大鼠角膜组织中Dectin-1的表达量;3.提取和收集RNA,采用QRT-PCR技术分别测定并比较各组大鼠Dectin-1、TNF-α、IL-17、IL-12的mRNA表达水平。结果1.病理学结果对照组大鼠的角膜完整、没有水肿和炎症细胞浸润现象;实验组1和实验组2大鼠角膜可见水肿增厚、溃疡处上皮缺失前弹力层、前房及基质中有较多中性粒细胞浸润。2.免疫组化结果对照组和实验组1的大鼠角膜组织中dectin-1受体的表达始终呈弱阳性;真菌感染1天后,实验组2的大鼠角膜组织中dectin-1受体的表达就开始呈现强阳性,一直持续到第5天。3.QRT-PCR检测结果（1）对照组、实验组1和实验组2大鼠角膜组织中都有Dectin-1、TNF-α、IL-12的表达。（2）在对照组和实验组1大鼠角膜组织中均没有IL-17的表达。（3）实验1天后,实验组2大鼠角膜组织细胞中Dectin-1的表达量比对照组和实验组1明显增加（P<0.05）,实验组1大鼠角膜组织中Dectin-1的表达量与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。（4）实验组1大鼠角膜组织中IL-12、TNF-α的表达量比对照组明显增加（P<0.05）。（5）实验组2大鼠角膜组织中IL-12的表达量在第1天到第3天持续增加,而TNF-α的表达量在第1天到第5天持续增加。结论1.在真菌感染后,大鼠角膜组织中的Dectin-1表达量增加,Dectin-1的表达量可能和炎症反应的应答程度密切相关。2.IL-17的合成可能依赖于Dectin-l受体介导的细胞内信号通路。3.IL-12可能在真菌感染的早期发挥作用,Dectin-l受体参与炎症因子IL-12的表达,IL-12还受其他类型的细胞受体所诱导。4.TNF-α因子参与真菌性角膜炎角膜组织炎症反应,且该因子的表达水平和Dectin-1受体没有显著的关系,其可能经细胞上的其他受体诱导的信号转导途径所调控。