背景：　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国南方和东南亚最为常见的肿瘤之一,尤其在华南地区发病率高,具有地域流行性,有“广东瘤”之称。在广东中西部高发区的调查发现,鼻咽癌年发病率为18.1/10万,仅次于肺癌和肝癌列恶性肿瘤的第三位。　　 尽管鼻咽癌的病因学目前仍然不是非常清晰,但EB病毒与鼻咽癌的关系已经得到确认。EB病毒((Epstein-Barr virus,EBV)是人类特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒,通过唾液传播,通常潜伏于呼吸道。几乎所有高发区的鼻咽癌患者,在其血液和组织标本都可以检测到EB病毒的存在。　　 多个研究表明,与EB病毒抗原相关的抗体是鼻咽癌早期诊断非常有价值的标记物。目前,常用于鼻咽癌诊断的EBV血清学检查项目为IgA-EA和IgA-VCA,尤其在鼻咽癌高发区,患者EB病毒感染的发生率很高,鼻咽癌患者血IgA-VCA抗体阳性率为90.0％,IgA-EA抗体阳性率为74.5％,抗体滴度与病毒的感染相关。　　 PCR扩增技术(Polymerase chain reaction,PCR)是由美国科学家Kary Mullis1985年发明。采用此技术检测血浆EBV DNA的定量已成为鼻咽癌临床诊治的一个非常重要的手段。Mutirangura A和Lo相继使用荧光定量PCR在鼻咽癌患者的血清和血浆中检测到EBV—DNA,并进一步发现EBV DNA浓度与肿瘤的分期、预后相关,Lin等通过对鼻咽原发肿瘤组织和血浆EBV DNA进行测序,发现二者的基因序列基本一致,证明了血浆中的EBV DNA正是来源于鼻咽癌细胞,为血浆EBV DNA定量检测在鼻咽癌临床诊治中的应用提供了最直接的理论依据。　　 为进一步探讨鼻咽癌患者血浆EBV DNA浓度与生存的关系,为个体化的综合治疗选择提供分子学指标,我们设计此前瞻性研究,分为四部分完成.:　　 一、鼻咽癌血浆EBV DNA、肿瘤体积和生存的相关分析；　　 二、鼻咽癌血浆EBV DNA动态变化对预后的影响；　　 三、鼻咽癌血浆EBV-DNA与血清学抗体对照分析；　　 四、xMAP技术检测鼻咽癌EB病毒多项抗体动力学研究。　　 第一章鼻咽癌血浆EBV DNA、肿瘤体积和生存的相关分析　　 目的:研究鼻咽癌肿瘤体积与分期的关系,以及治疗前血浆EBV DNA浓度与分期、肿瘤体积的关系,评价血浆EBV DNA是否代表肿瘤负荷、并了解其对预后的影响。　　 方法:2004年2月到2008年4月中山大学附属肿瘤医院收治的初诊鼻咽癌180例,收集患者的临床资料和治疗前后的外周血标本,采用RT-PCR检测EBVDNA,全部患者均采用IMRT计划工作站勾画肿瘤靶区和计算肿瘤体积和采用IMRT技术放疗。肿瘤体积和EBV DNA的相关性采用Spearman correlations分析,Kaplan Meier法计算和绘制生存曲线,多因素分析采用Cox回归模型。　　 结果:全组中位GTVnx21.60 cm3(范围1.04～164.59)；颈部转移淋巴结体积(GTVnd)20.16cm3(范围0～82.33)；肿瘤总体积(TTV)31.47 cm3(范围2.37～164.59)。分期与肿瘤体积之间存在正相关关系,肿瘤随着分期顺序性增加,分期之间,肿瘤体积具有显著差异,同一分期内,肿瘤体积有重叠。治疗前血浆EBVDNA的检出率为82.78％(149/180),中位EBV DNA为14609 copies/ml(范围0～5820000),EBV DNA与T分期和鼻咽肿瘤体积(GTVnx)呈正相关关系,EBVDNA浓随着肿瘤体积的增大而升高(p值<0.01),各体积分组之间的差异非常显著性(p值=0.001)。N分期和颈部淋巴靶体积(GTVnd)与EBv DNA浓度相关,但相关系数较小。治疗前血浆EBV DNA浓度能较好地反映体内肿瘤负荷。　　 全组病例中位随访时间为48个月(范围25～78个月),治疗结束时171例患者达到临床完全缓解(CR),9例残留,其中鼻咽局部残留4例,颈部淋巴结残留4例,鼻咽和颈部残留1例。CT和/或MRI及病理组织学证实复发18例,6例局部复发,区域复发9例,局部和区域复发3例；38例发生远处转移,其中,骨转移10例,肺转移8,肝转移6,多部位13例；3例患者出现复发和转移。全组28例死亡,4年总生存率(OS)85.6％；4年无复发生存率(LFFS)91.1％；4年无转移生存率(MFS)80％；4年无进展生存率(PFS)72.8％。　　 根据ROC曲线下面积计算疗前EBV DNA临界值,诊断复发、转移、死亡的临界值分别为4703.01、4920、7949.98copies/ml。疗前EBV DNA临界值诊断的敏感性高,位于97.37～100％之间,但特异性较低,位于43.21～49.30％,根据特异性分析,疗前EBV DNA对转移和死亡的预测价值一般,对复发的预测价值较低,但都具有统计学意义(p<0.01)。多因素分析结果显示,EBV DNA是无进展生存和无转移生存的独立预后因素,但对于无复发生存没有意义。肿瘤体积不是独立的预后因素,对无复发生存率和无远处转移生存率的影响都不具有统计学意义。　　 结论:鼻咽癌肿瘤体积与分期密切相关,肿瘤体积对于复发和转移不是独立的预后因素,可能与本研究组全部患者均采用调强适形放疗技术有关。　　 治疗前血浆EBV DNA浓度与分期、肿瘤体积密切相关,能提供准确的肿瘤负荷信息。生存分析显示EBV DNA是无转移生存和无进展生存的独立预后因素,有利于在治疗前对患者进行风险评估,筛选出预后风险大的患者。其预后价值受到特异性不强的限制,需结合分期系统联合应用。　　 第二章鼻咽癌EB病毒DNA动态变化对预后的影响　　 目的:分析治疗后的不同时段EBV DNA的动态变化规律,探讨疗后血浆EBVDNA动态变化对复发和转移的风险的预测价值,以及其对预后和生存的影响。　　 方法:180例初治鼻咽癌患者分别在以下时段抽血:治疗前一周、诱导化疗后、同期放化疗前、放疗结束后一周、治疗后3个月、以及治疗后1、2、3、4、5年各采血一次,18例复发患者在复发时、38例远处转移患者在转移时、以及转移和复发治疗后各采集外周血标本一次。采用荧光定量PCR技术检测血浆EBV DNA浓度,Kaplan Meier法计算和绘制生存曲线,多因素分析采用Cox回归模型。　　 结果:180例患者治疗结束时,EBV DNA阳性率由治疗前83.33％下降为治疗后19.44％(35/180),中位EBV DNA浓度由治疗前下降1.4609copies/ml至0copied/ml(P<0.01)。疗后EBV DNA动力学显示持续缓解组和复发组、转移组存在明显差别,持续缓解组疗后EBV DNA上升幅度低,复发和转移两组放疗结束时EBV DNA也迅速下降,中位EBV DNA均为0,疗后3～6个月开始逐渐上升。复发组和转移组两组之间不存在统计学差异。根据ROC曲线下面积计算疗后EBV DNA临界值,诊断复发、转移、死亡的临界值分别为1925、2760、11400 copies/ml,临界值对于复发、转移和死亡诊断的敏感性和特异性分别为92.12～100％、84.38～92.62％,特异性和敏感性均明显超过治疗前EBV DNA。疗后临界值影响预后的独立生存因子,即使治疗前EBV DNA浓度高,只要疗后EBV DNA波动的范围低于临界值,预后仍然良好,而疗前EBV DNA的作用可以忽略；疗后EBV DNA持续超过临界值的患者预后差,发生临床事件的几率达到80.95％。　　 结论:本组80.56％鼻咽癌患者治疗结束时EBV DNA浓度降低至0copied/ml。持续缓解组患者治疗后EBV DNA也存在波动,但波动的幅度较低,转移和复发两组患者治疗后3～6个月EBV DNA开始逐步上升。疗后EBV DNA对生存预测的特异性高,达到84.38～92.62％,敏感性为92.12～100％。疗后EBVDNA不仅是无复发生存和无远处转移生存的独立预后因素,也是影响无进展生存和总生存率的独立预后因素,只要疗后EBV DNA升高超过临界值,往往意味着预后不良,其对预后和生存的影响超过治疗前EBV DNA。　　 治疗前EBV DNA价值在于提供准确的肿瘤负荷信息,在治疗前对患者进行风险评估,筛选出预后风险大的患者,其预后价值受到特异性不强的限制,需密切结合疗后EBV DNA的变化,如果疗后DNA持续高于临界值,预后风险明显增加,缩短随访间隔是必须的,以便在早期给予及时的救援治疗。建议将疗后血浆EBV DNA浓度作为疗效监测的重要手段。　　 第三章鼻咽癌血浆EBV-DNA与血清学抗体对照分析　　 目的:通过测定鼻咽癌患者IgA-VCA、IgA-EA在治疗前后的不同时段抗体滴度变化,并与EBV DNA浓度的动态变化进行对比,分析两者诊断和预后的价值,以期为临床应用提供指导。　　 方法:收集180例鼻咽癌患者治疗前后的外周血样本,采用RT-PCR检测EBVDNA、免疫酶染色法检测IgA-VCA、ELISA检测IgA-EA。分析治疗前IgA-VCA、IgA-EA与分期、肿瘤体积和EBV DNA的相关性；对比IgA-VCA、IgA-EA与EBV DNA在治疗前、后的动态变化；采用ROC曲线下面积分别计算血清学抗体和EBV DNA的敏感性和特异性；Kaplan Meier法计算和绘制生存曲线,多因素分析采用Cox回归模型。　　 结果:治疗前IgA-VCA阳性率为96.7％,治疗后阳性率不变,中位数由疗前1:320降至疗后1:160；治疗前EA-VCA阳性率为61.67％,治疗后阳性率升高至71.11％,中位数由疗前1:20降至疗后1:10；EBV DNA阳性率由治疗前83.33％降至治疗后19.44％,中位数由治疗前14609 copies/ml降至治疗后0 copies/ml。EBV DNA在治疗前后变化显著,此外,EBV DNA还与分期相关(x2=36.32,p=0.001)和肿瘤总体积相关(x2=58.25,p:0.001),IgA-VCA、IgA-EA与分期和肿瘤体积之间均缺乏相关性,但IgA-VCA、IgA-EA与EBV DNA之间是具有相关性的(P<0.001)。治疗前、后IgA-VCA、IgA-EA在复发组、远处转移组、和持续缓解组之间不存在显著性差异；而治疗前、后血浆EBV DNA分别在3组之间均显著差异(P=0.001)。　　 ROC曲线下面积分析结果为:疗前IgA-VCA、IgA-EA的敏感性分别为:58.52～94.44％、48.28～88.89％；IgA—VCA、IgA—EA特异性分别为24.07～49.01％、25.31～57.62％；疗前EBV DNA敏感性为97.37～100％、特异性为43.21～49.67％,治疗前血清学抗体的敏感性和特异性与EBV DNA无显著差别。疗后IgA—VCA、IgA—EA的敏感性分别为:42.86～88.89％、34.43～75％:IgA-VCA、IgA-EA的特异性分别为16.78～63.45％、29.661～72.79％；疗后EBV DNA敏感性为92.12～100％；特异性为84.38～92.62％。疗后血清学抗体的敏感性和特异性均较EBV DNA低,差别具有显著意义(P<.001)。　　 结论:疗前IgA-VCA、IgA-EA敏感性和特异性与EBV DNA无显著差别,血清学抗体可用于鼻咽癌的诊断,但IgA-VCA、IgA-EA与分期、肿瘤体积都缺乏相关性,不利于鼻咽癌分期和肿瘤负荷的评估。　　 疗后IgA-VCA、IgA-EA敏感性和特异性均明显低于EBV DNA,其判断进展和预后的价值较低,需和EBV DNA联合应用。治疗后EBV DNA对于复发、转移、进展、生存预测的特异性最强。　　 第四章 xMAP技术检测鼻咽癌EB病毒多项抗体动力学研究　　 目的:EBV的血清学检查广泛应用于鼻咽癌,但传统的免疫检测定量分析法受NEB病毒抗体在短时间内变化不大的局限,在我们的研究中,拟采用xMAP的技术,分析8种EBV的生物标记物在鼻咽癌治疗过程中的动态变化,分析8项血清EBV抗体的波动对预后的影响。　　 方法:应用xMAP技术,对35例鼻咽癌患者放疗前、中、后8种EBV抗体进行检测,并绘制出抗体动力学曲线。　　 结果:在放疗中可以观察到EBV8种抗体最初的波峰,两位患者表现为先下降,然后再上升,在随诊期间,大多数患者的EBV抗体活性都显示下降。复发的鼻咽癌患者在治疗后,可以观察到EBV抗体水平短时间的上升。　　 结论:鼻咽癌患者放疗前、中和放疗后随诊期间,8项EBV抗体水平的动态变化可能和肿瘤细胞的活性相关,xMAP技术可以联合检测多项EBV血清学抗体的变化,通过8种抗体的强度变化监测肿瘤在体内的状态。