嗜肺性军团菌是一种胞内寄生菌,以阿米巴原虫为自然宿主,广泛存在于自然界中。人们多因吸入污染的气溶胶而感染,引起以肺部炎症为主要特征的疾病,称为军团杆菌病(legionellosis)。军团菌可以在肺泡巨噬细胞或者单核细胞内复制增殖,军团菌侵入细胞后,会形成一个被生物膜包裹的囊泡结构,称为LCV (legionella containing vacuole)。LCV可以从内吞途径中逃逸出来,募集宿主细胞的组分,最终形成一个表面被内质网成分、核糖体和线粒体成分覆盖的膜结构,军团菌可以在其中复制增殖。LCV的形成和发育取决于一个称为Dot/Icm的Ⅳ型分泌系统,这一分泌系统也是军团菌胞内存活的分子基础。通过Dot/Icm系统,军团菌向胞浆内分泌了大量的效应蛋白,目前已鉴定出至少275个效应蛋白。这些蛋白可以作用于宿主细胞的各个生物学过程,从而有利于军团菌在胞内的复制增殖。通过探究这些效应蛋白的生物学功能,可以为进一步揭示军团菌胞内存活的分子机理提供理论依据。首先利用酵母系统,筛选可以抑制酵母生长的军团菌效应蛋白,进而利用生物、生化手段对这些效应蛋白进行研究。利用这一方法,获得了一些可以完全抑制酵母生长的效应蛋白,如ankX、 SidI、Ceg14等,本论文重点研究Ceg14的生物学功能。Ceg14可以完全抑制酵母生长,通过随机突变分析,确定了两个氨基酸位点,第234位甘氨酸和第623位的苏氨酸,对Ceg14的生物学功能至关重要。通过抑制子筛选实验,发现高表达酵母前纤维蛋白(profilin)可以抑制Ceg14对酵母的毒性,而前纤维蛋白在肌动蛋白(actin)的组装过程中发挥着重要作用。之前利用蛋白质组学分析LCV的膜成分发现,除了其它细胞组分外,在LCV膜上有许多与细胞骨架组装相关的组分,如肌动蛋白、前纤维蛋白、丝切蛋白(cofilin)等。说明军团菌可以修饰宿主细胞骨架,通过改变细胞骨架的重排,从而实现LCV的转运和胞内的存活。最近发现效应蛋白VipA可以直接结合肌动蛋白,体外分析显示,VipA可以作为成核剂,促进肌动蛋白单体(G-actin)的聚集,从而增强肌动蛋白在体外的聚合,该结果表明Ceg14可能影响宿主细胞骨架的组装。利用荧光显微镜技术,观察到Ceg14的表达可以破坏酵母的细胞骨架,导致酵母无法出芽；体外利用共沉淀(Co-sedimentation)、荧光分光光度计动态检测肌动蛋白单体聚合等实验方法,发现Ce14可以抑制肌动蛋白单体的自发聚合作用,并且Ceg14G234v和Ceg14T623N失去了这一功能。进一步用荧光显微镜观察单个的肌动蛋白丝,发现Ceg14会导致产生更多的短的肌动蛋白丝。体外的数据显示,Ceg14可以抑制肌动蛋白单体的自发组装,这是首次发现军团菌的效应蛋白可以负调控肌动蛋白的组装,不同于VipA的促进作用,从另一方面也体现了军团菌对宿主细胞修饰的复杂性。此外,同其它大多数效应蛋白一样,敲除Ceg14和VipA的菌株在A/J小鼠的巨噬细胞内和阿米巴原虫内可以正常复制增殖,说明可能有其它更多的效应蛋白参与进来,弥补了Ceg14和VipA的生物学功能。本研究结果为深入解析军团菌的致病机理提供了一定的参考。