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目的:本文拟通过制备人源化的RPP蛋白,并研究其与HCV5’UTR在体外的结合活性。在此基础上,进一步探讨宿主细胞RPP蛋白对HCV增殖的影响。方法与结果:全文共分两大部分:一、人源化RPP蛋白与HCV 5’UTR体外结合的研究。首先构建重组RPP基因的慢病毒载体,将其转染HEK293T细胞包装慢病毒并感染HEK293细胞,通过流式细胞仪分选,成功获得四种稳定表达人RPP蛋白的细胞系(分别是Rpp20、Rpp21、Rpp25和Rpp29)。进一步将上述细胞系扩增培养,经Bio-Rad蛋白纯化仪纯化及SDS聚丙烯酰胺电泳鉴定,结果四种RPP蛋白都有表达且纯度较好。此外,通过体外32P-UTP参入的体外转录,制备同位素标记的HCV 5’UTR(nt 1-341)作为靶RNA片段,通过EMSA试验检测人源化的RPP与靶RNA的体外结合活性。结果发现,四种RPP均可与HCV5’UTR直接结合,其中Rpp20结合力相对较弱,而Rpp29的结合力则最强。二、宿主细胞RRP蛋白对HCV增殖的影响。将构建的四种RPP基因慢病毒分别感染Huh7.5.1细胞,以上调细胞RPP蛋白的表达,再感染HCV病毒。通过荧光定量PCR测定感染细胞及上清中HCV的滴度,结果发现,上述RPP蛋白的过表达均可显著抑制HCV病毒的增殖,其中Rpp29蛋白的抑制作用最强。与此同时,通过RNA干扰技术(RNAi)分别沉默宿主细胞中上述四种RPP蛋白的表达,结果发现Rpp20的沉默对HCV的增殖无明显影响,而Rpp21、Rpp25和Rpp29蛋白的沉默则将显著促进HCV病毒的增殖。结论:人RNase P的蛋白亚基Rpp21、Rpp25和Rpp29可作为宿主细胞的负调控因子参与HCV的增殖过程,而且这种调控可能是通过与HCV RNA 5’UTR直接结合的方式发挥作用。本研究一方面拓展了对人RNase P蛋白组分生物学功能的认识,另一方面也揭示出一种HCV病毒复制调控的新机制。