论文部分内容阅读
生物素AP-tag技术是指在目的蛋白的N端或C端加上由15个氨基酸（GLND IFEAQKIEWHE)组成的受体肽（acceptor peptide，AP)小标签，该小标签可被生物素连接酶BirA特异性识别，B irA酶可催化生物素转移到靶标蛋白标签上的赖氨酸残基上，导致带有标签的靶标蛋白在体内或体外都能被生物素化。该生物素化过程为酶促反应，反应条件相当温和而且标记的专一性极高。生物素AP-tag技术具有高效、位点特异及操作方便等特点，同时由于序列短小，对靶标蛋白的构象及活性影响极低。链霉亲和素可以专一地与生物素结合，且两者间的结合力是自然界已知的最强的非共价结合作用力，结合常数Kd值高达10-15mol/L，比抗原与抗体间的结合力高1万倍。因此，可在严格的洗脱条件下分离出目标蛋白及其蛋白特异性相互作用的复合物。F0XM1是Forkheadbox转录因子家族的成员之一，它与细胞增殖、衰老、DNA损伤修复、再生和肿瘤等许多生理病理过程都有密切关系。 本研究构建基于生物素AP-tag的F0XM1真核表达载体，利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对F0XM1蛋白进行纯化，为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pcDNA-AP-FOXMl和大肠杆菌生物素连接酶BirA真核表达载体pcDNA-BirA，将pcDNA-AP-FOXMl和pcDNA-BirA共转染人胚肾293T细胞，使用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的F0XM1，通过银染及Western印迹检测细胞裂解液以及亲和纯化后的蛋白复合物，确定了相关蛋白表达情况。研宄发现AP-F0XM1在 HEK293T细胞中被生物素化且该蛋白在Western印迹、pull down等实验中可实现无需抗体的一步法应用。另外，分别构建了的pcDNA-AP-FOXMl(l-224aa)和pcDNA-AP-FOXMl(l-353aa),在细胞内表达不同长度的可生物素化的F0XM1,并验证了FOXM1的互作蛋白p-catenin与 F0XM1的C端发生互作，为研宄F0XM1与其他蛋白的细节互作关系提供了有效工具。