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研究背景流行病学研究显示高脂血症和骨质疏松症存在密切联系,美国NHANES Ⅲ调查指出63%的骨质疏松症患者合并有高脂血症。并且血清脂蛋白水平升高会导致骨量丢失,骨密度降低,高脂血症的患者发生骨折的风险也大大增高。而临床上单纯的骨合成代谢疗法并不能完全治疗合并高脂血症的骨质疏松症。因此明确高脂血症导致骨质疏松症的的病理机制,有希望找出新的药靶位点,是对骨质疏松症防治工作的重要补充。目的1.鉴定高脂血症体内引发骨质疏松症时直接作用的靶细胞。2.揭示高脂血症引发骨质疏松症过程中的具体分子机制。方法1.高脂血症小鼠动物模型的构建及对骨组织表型的影响我们采用3月龄的雄性SPF级C57BL/6野生型和LDLR基因敲除小鼠作为实验对象,喂养高脂饮食(Western diet)3个月,构建高脂血症动物模型。通过心脏采血测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和丙二醛(MDA)浓度来评估模型构建情况。采用micro-CT,免疫组化染色观察骨形态的改变情况。同时分离出实验小鼠的骨髓间充质干细胞进行体外诱导培养,测定CFU-F,CFU-Ob,钙结节沉积和成骨相关基因的表达,观察高脂血症对小鼠骨组织的整体影响。2.高脂血症体内直接影响小鼠骨组织靶细胞的鉴定通过小鼠尾静脉注射荧光标记的氧化低密度脂蛋白(dil-oxLDL)和荧光标记的低密度脂蛋白(dil-nativeLDL),4小时后对小鼠实行安乐死,收集双侧下肢骨,行冰冻切片,激光共聚焦显微镜观察骨髓腔内荧光物质的摄取情况。同时通过骨髓腔冲洗分离出尾静脉注射小鼠的髓腔内细胞,采用流式细胞仪分选出摄取相应脂类物质的细胞群。然后从正常饮食喂养的野生型C57BL/6小鼠髓腔内分离出相应的细胞群,体外施加oxLDL及POVPC干预,通过CFU-F,CFU-ob,ALP及茜素红染色,PCR检测成骨相关基因的表达来观察氧化脂质对该群细胞增殖和成骨分化的影响,并进一步行qRT-PCR,Western-blot,观察氧化脂质对该群细胞成骨相关信号通路的影响。3.高脂血症时直接影响小鼠骨组织的分子机制研究运用蛋白质和脂质覆盖法(protein lipid overlay assay,PLO)检测高脂血症时升高的oxLDL与BMSCs膜表面相互作用的特定蛋白及结构域。流式细胞仪检测高脂饮食小鼠髓腔内BMSCs膜表面LRP6的变化情况,并运用基因沉默,免疫荧光示踪的方式,在激光共聚焦显微镜下观察oxLDL与LRP6的结合及胞吞的过程。Western blot及蔗糖梯度离心法,检测oxLDL结合LRP6后介导的胞吞信号通路。并运用胞吞信号通路阻滞,质粒转染MESD促细胞膜表面LRP6蛋白表达等技术手段,观察是否能逆转oxLDL对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨抑制作用。结果1.高脂血症小鼠模型的构建及对骨组织表型的影响对比正常饮食组,3月龄C57BL/6小鼠经过3个月高脂饮食(western diet)喂养,可以引起血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)指标升高,高密度脂蛋白(HDL)降低,丙二醛(MDA)升高,诱发高脂血症,以LDLR基因敲除小鼠更为明显。高脂血症会引起小鼠骨质疏松表现,主要通过抑制髓腔内骨骼干细胞的成骨分化,降低成骨细胞数量实现,然而短期的高脂饮食喂养暂未发现促进破骨增强的证据。2.高脂血症体内直接影响小鼠骨组织靶细胞的鉴定免疫荧光示踪技术显示,高脂血症时oxLDL在小鼠骨髓腔内主要被骨髓间充质干细胞(BMSCs)摄取,巨噬细胞在骨髓腔内并不参与oxLDL的吞噬。进一步的体外实验证明了,高脂血症时升高的oxLDL在髓腔内直接被BMSCs摄取,抑制了其成骨分化能力,干扰了 Wnt,BMP和PTH等成骨相关信号通路的转导。3.高脂血症时直接影响小鼠骨组织的分子机制研究PLO、蔗糖梯度离心法和免疫荧光共定位检测显示oxLDL直接与BMSCs细胞膜表面的LRP6结合形成复合物,并经由clathrin通路胞吞入细胞内部,从而降低了细胞膜表面的LRP6数量,减弱了 Wnt,BMP,PTH等成骨相关信号通路的转导,抑制了 BMSCs的成骨分化能力。沉默LRP6的功能可以直接影响BMSCs对oxLDL的摄取,阻断clathrin通路或促进膜表面的LRP6表达均能改善oxLDL对BMSCs的成骨抑制作用。结论1.高脂饮食(Western Diet)喂养3个月可以成功构建出C57BL/6 LDLR-/-小鼠的高脂血症动物模型,小鼠的高脂血症会进一步引发骨质疏松症;2.高脂血症时升高的oxLDL通过直接影响骨髓腔内的BMSCs导致骨质疏松症;3.其具体机制是:oxLDL直接与BMSCs细胞膜表面的LRP6结合形成复合物,经由clathrin通路胞吞进入细胞,导致细胞膜表面的LRP6数量减少,从而减弱其他成骨相关信号通路的转导,抑制了 BMSCs向成骨细胞分化。这打破了成骨-破骨的动态平衡,最终引发骨质疏松症。