莱克多巴胺新型免疫荧光猝灭检测技术研究

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目的:以莱克多巴胺(Rac)为检测对象,建立高灵敏正读的荧光猝灭试纸条技术。方法:将抗Rac单克隆抗体标记在金纳米颗粒(Gold nanoparticles, Au-NPs)上,制备金标抗体猝灭剂(mAb-gold quencher),然后喷涂于结合垫上。将荧光颗粒直接以BSA封闭,并与Rac完全抗原按比例混合后,喷涂于硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane, NC膜)检测线(Test line, T-line)处。封闭后的荧光颗粒喷涂于NC膜上校准线(Calibration line,C-line)处作为对照。试纸条经一系列的条件优化后用以检测Rac添标磷酸盐缓冲液(PB)、猪尿、猪肉样品,通过荧光摄像仪和Image J图像处理软件获得定量的检测数据。同时,本研究对建立的Rac荧光淬灭试纸条的特异性、稳定性、回收率进行了评价。为了建立简便的液相免疫荧光检测系统,本研究将Rac抗原标记到多种不同的荧光纳米颗粒上,将Rac抗体标记到纳米金颗粒上用作金标抗体猝灭剂,根据一定比例以不同的添加方法添加到96孔黑底荧光酶标板中,尝试建立随着Rac竞争物浓度的变化而导致的荧光猝灭效率变化的响应系统。同时对试剂添加顺序,标记用荧光颗粒,标记对象进行了研究,以求得到适合用于免疫学检测的液相免疫荧光检测体系。结果:初步建立了高灵敏正读的Rac免疫荧光淬灭试纸条,该试纸条上T线上的荧光信号强度和样品的Rac浓度呈正相关。试纸条的灵敏度为0.16ng/mL,检测范围为0.16ng/mL-20ng/mL。以该荧光淬灭试纸条检测加标于猪尿、猪肉中到的Rac,批内重现性实验结果显示,该方法回收率在97.2%-106.1%之间,最大相对标准偏差为3.84%。对于批间重现性实验,回收率在89.0–109.1%之间,最大相对标准偏差为6.34%。该试纸条对其他相关竞争物没有交叉反应,具有较强的特异性。该试纸条在室温保存3个月后仍有很良好的稳定性。基于液相荧光能量猝灭体系的免疫学检测技术的研究发现,虽然待测物的加入可明显影响检测体系的荧光淬灭效率,但得到的结果并不如预期的线性曲线,基于抗原抗体反应的液相荧光猝灭体系的免疫学检测技术尚需进一步研究与发展。结论:成功的制备了检测Rac的免标记荧光猝灭试纸条,所制备的荧光淬灭试纸条具有检测信号和检测物浓度呈正相关,灵敏度高,操作简便,成本较低等优点,可以作为一种快速有效的检测小分子的手段。
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