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研究背景和目的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)，反复发作，迁延不愈，容易癌变。临床资料分析表明，UC病程8-15年，癌变发生率达22%，10-20年达28%，20年以上则高达43%。目前，结直肠癌的预防措施有：消除不良饮食习惯，服用化学预防药物，早期诊断及时治疗；其中针对性的化学预防可望在UC癌变中取得突破。UC癌变是一个漫长的过程，预防UC癌变不仅需要明确的药物作用靶点，而且需要预防药物无毒、无副作用。研究表明，核转录因子κB (NF-κB)是UC癌变的中心环节，其表达水平是炎症癌变的控制器。众所周知，结肠腔内存在大量共生菌及食物消化残渣，对结肠粘膜上皮细胞具有潜在的侵袭作用。正常情况下，结肠粘膜一方面靠本身分泌的粘液加以保护，另一方面靠其表面存在的各种模式识别受体通过识别不同病原生物性物质，启动免疫反应，维持肠道内环境稳定。临床研究发现，UC患者肠道菌群发生改变，G-/G+菌比值显著增加。我们的研究发现，糖聚合度为5的β-(1→4)–半乳寡糖醛酸(AOG)可显著预防实验性结肠炎癌变(93.5%)，动物用药4个月，未见到任何毒性反应。AOG单独使用可引起结肠上皮细胞膜TLR-4的表达升高，而与LPS合用却显著降低了TLR-4在细胞膜的表达。但其结合位点及分子机制尚不明确。而TLR-4与LPS的构象研究揭示，TLR-4激动剂LPS正是促进了MD-2-TLR-4寡聚化，升高细胞膜TLR-4的表达水平；而TLR-4的拮抗剂（Eritoran）则抑制MD-2-TLR-4的寡聚化，降低细胞膜TLR-4的表达，从而降低NF-κB的活化水平，抑制炎症反应的发生。提示，影响TLR-4在膜的表达，调控NF-κB的活性，将是发掘UC癌变预防药物的可行之路。本课题拟通过构建TLR-4、MD-2野生型及突变体慢病毒载体，CD-14慢病毒载体，TLR-4、MD-2基因敲除慢病毒载体；并构建TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信号通路在HEK293T细胞中的表达。观察AOG、LPS单独和联合使用对TLR-4/MD-2/NF-κB信号通路的影响；观察TLR-4和MD2敲除后，AOG和LPS处理HT-29细胞对TLR-4/MD-2/NF-κB信号通路的影响；观察过表达TLR-4和MD2，对AOG和LPS诱导的TLR-4/MD-2/NF-κB信号通路活化的影响；观察TLR-4和MD-2突变体对LPS和AOG诱导的TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信号通路的影响。从而揭示AOG预防结肠炎癌变的分子机制。实验方法1、用ELISA试剂盒测定上清中TNF-α的释放量，观察AOG和LPS对HT-29细胞TNF-α释放水平的影响；2、用Western Blotting来检测HT-29细胞中NF-κB P65亚基磷酸化水平，从而判断AOG和LPS对NF-κB活化程度的影响；3、用Cell Surface Biotinylation方法在HT-29细胞中检测AOG、LPS单独和联合使用对细胞表面TLR-4表达水平的影响；4、以慢病毒为载体，通过shRNA对TLR-4和MD-2蛋白干扰沉默后，用qRT-PCR检测shRNA的干扰效果，进而对TLR-4以及MD-2的shRNA进行筛选。5、以慢病毒为载体，利用筛选出的shRNA对TLR-4和MD-2干扰沉默后，分别加入LPS及AOG，用ELISA试剂盒测定上清中的TNF-α的含量，用WesternBlotting测定NF-κB P65亚基磷酸化水平。6、利用慢病毒为载体，通过慢病毒感染，在HT-29细胞中单独或共过表达TLR-4和MD-2蛋白后，分别加入LPS和AOG，用ELISA试剂盒测定上清中的TNF-α的含量，用Western Blotting测定NF-κB P65亚基磷酸化水平7、用TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase荧光素酶报告系统检测TLR-4突变体、MD-2突变体检测LPS和AOG诱导的TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信号通路的影响；8、用TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase荧光素酶报告系统检测MD-2K122R突变体对LPS和AOG共同诱导的TLR-4/MD-2/NF-κB-luciferase信号通路的影响；9、用免疫共沉淀法检测MD-2K122R突变体对TLR-4和MD-2复合体形成的影响。结果1、AOG单独使用可诱导TNF-α释放、激活HT-29细胞的NF-κB信号通路；而和LPS联合使用则会抑制抑制LPS诱导的TNF-α的释放及NF-κB信号通路，竞争性地抑制LPS引起的NF-κB活化；2、AOG单独使用可促进HT-29细胞的TLR-4蛋白在细胞膜上的表达，与LPS联合应用则抑制其引起的TLR-4在膜的表达；3、AOG激活NF-κB信号通路依赖TLR-4、MD-2蛋白，敲除TLR-4和MD-2蛋白表达能抑制AOG对NF-κB信号通路的激活；4、TLR-4突变体TLR-4R264A对LPS和AOG激活NF-κB信号通路都没有明显的影响；而突变体K341R和K362R大大降低了LPS和AOG对NF-κB信号通路的激活，但相对于AOG而言其对LPS的影响较大；5、MD-2突变体K58R明显减低了LPS和AOG对NF-κB信号通路的激活。突变体S118A对LPS和AOG激活NF-κB信号通路的影响不大；而突变体K122R不影响LPS对信号通路的激活，而基本完全抑制了AOG的激活作用；6、通过TLR-4和MD-2突变体对LPS及AOG诱导的NF-κB信号通路的影响可以看出，虽然LPS和AOG对NF-κB信号通路的激活均依赖于TLR-4和MD-2蛋白，可能均需要形成LPS/TLR-4/MD-2以及AOG/TLR-4/MD-2复合体，但LPS和AOG与TLR-4、MD-2的结合位点明显不同；7、LPS和AOG单独使用均能激活NF-κB信号通路，而联合使用则抑制NF-κB信号通路。结论AOG激活NF-κB信号通路依赖TLR-4、MD-2蛋白，敲除TLR-4和MD-2蛋白表达能抑制AOG对NF-κB信号通路的激活，推测AOG激活NF-κB和LPS类似，需要形成AOG/TLR-4/MD-2复合体。 TLR-4的341和362位赖氨酸对LPS/TLR-4/MD-2以及AOG/TLR-4/MD-2形成的复合体均有很大影响，对LPS/TLR-4/MD-2复合体影响更大。MD-2122赖氨酸突变成精氨酸对AOG激活NF-κB信号通路更为重要，可能是AOG、TLR-4和MD-2形成的复合体中的关键氨基酸。LPS和AOG单独使用均能激活NF-κB信号通路，而联合使用则抑制NF-κB信号通路。LPS和AOG和TLR-4、MD-2的结合位点明显不同，我们推测LPS和AOG联合使用时，可能需要和TLR-4/MD-2形成各自不同构象的复合体，因需要和TLR/MD-2形成各自的最适构象，而使LPS/TLR-4/MD-2和AOG/TLR-4/MD-2均不能形成有效的复合体，导致对下游信号通路的激活反而更低，进而出现了联合使用反而抑制的现象。