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β-1,4-内切木聚糖酶(以下称木聚糖酶)是木聚糖最关键的水解酶之一,可广泛应用于食品、饲料和造纸等领域。多数常规的野生型或重组木聚糖酶的催化活性较低、稳定性较差,难以满足在不同应用领域的需要。本研究克隆到解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A基因(baxA),并在Escherichia coli BL21(DE3)和Pichia pastoris GS115中获得分泌表达;采用定向进化技术(易错PCR和DNA改组)对该酶进行改造,以期获得具备较理想酶学性质的突变体;同时揭示与解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A催化活性、热稳定性相关的部分关键氨基酸位点或区域。主要结果如下:1.克隆得到baxA基因并成功构建获得分泌表达的大肠杆菌工程菌pCbaxA15。以实验室前期分离的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为出发菌,设计特异性引物克隆到baxA基因(GenBank登录号:KM 624029),该基因的开放阅读框(ORF)为642 bp,编码213个氨基酸残基,含6个潜在糖基化位点,理论分子量为23.3 kDa。baxA定向插入到新型表达载体pCold TF中,并转化E.coli BL21(DE3),在15°C下诱导表达,重组酶(reBax A)能够分泌到培养基中;采用高亲和Ni-树脂层析纯化reBax A,纯化后的reBax A比活为2.63 U/mg;纯化SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,该重组酶的分子量约为77.3 kDa。酶学性质研究结果表明,reBaxA的最适温度和最适pH分别为55°C,pH 6.0;Km、Vmax分别为16.05 mg/m L、45.66μmol/min/mL。reBax A分别水解燕麦、山毛榉、桦木木聚糖,水解产物为木二糖至木五糖(X2-X5),主要产物分别为木四糖(X4)、木三糖(X3)、木五糖(X5)。baxA基因定向插入pET30a(+),转化E.coli BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western Blot和活性测定分析结果表明,baxA获得了重组表达,特异性条带明显,但表达产物无木聚糖酶活性,推测重组蛋白主要以包涵体形式存在。2.成功构建获得分泌表达的毕赤酵母工程菌PPbax A10。baxA基因定向插入穿梭载体pPICZαA,重组质粒pPICZαA-baxA线性化后电击转化P.pastoris GS115感受态细胞,经过Zeocin抗性、PCR鉴定和活性检测,获得酵母工程菌PPbax A10,其接种于50 m L YPD培养基中,从第24 h开始添加甲醇诱导,第120 h时,该工程菌发酵上清木聚糖酶比活为8.18 U/mg,Km,Vmax分别为5.41mg/m L,22.42μmol/min/mL。在50°C,pH 5.0时,rePPBax A10表现出最高的活性。3.采用易错PCR技术构建突变文库,筛选得到酶活提高的突变体pCbaxA50。在baxA基因PCR扩增体系中,提高Mg2+和dTTP,dCTP的浓度,并额外添加Mn2+,该引物中限制性内切酶识别位点外侧均引入3个保护性碱基,故PCR产物的胶回收产物直接用于双酶切,并定向插入表达载体pCold TF中,转化E.coli BL21(DE3),构建表达文库,共获得1463个单菌落,采用96孔板法快速筛选突变文库,其中pCbaxA50分泌的胞外重组酶活性较高,测序结果表明,存在一个氨基酸残基突变,S138T;重组酶reBaxA50的比活为9.38 U/mg,其最适温度和最适pH分别为50°C,pH 5.0。突变酶在60°C时的半衰期为9.74min,TGA-DSC分析结果表明突变酶和其亲本的Tm值分别为89.15°C和88.95°C。4.结合褐色高温单孢菌木聚糖酶基因,采用DNA改组技术对解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A进行改良。根据载体序列设计一对通用引物,克隆得到褐色高温单孢菌木聚糖酶基因的催化域序列(tfxCD)与baxA基因的成熟肽编码序列(mbaxA),二者混匀后经DNaseⅠ随机片段化,割胶回收分子量小于100 bp的DNA片段并进行无引物PCR,在此基础上进行有引物PCR,所得产物双酶切后定向插入表达载体pCold TF,转化E.coli BL21(DE3),构建突变文库,共得到2250个单菌落。采用96孔板高通量筛选得到酶活提高的突变体pCbaxA153,pCbaxA241,pCbaxA428,还选取了酶活下降的突变体pCbaxA199。4个突变酶,reBaxA153,reBaxA199,reBax A241,reBaxA428中分别产生了N29S,T33I,S31R,I51V的氨基酸突变,比活分别为11.95,2.17,11.45,10.26 U/mg。其中,reBaxA199在碱性条件最稳定,reBaxA241对热最稳定,reBaxA428对酸最稳定。突变酶reBax A153和reBaxA428对不同木聚糖水解模式相似,水解山毛榉木聚糖最彻底,而reBaxA241对三种木聚糖都有良好的水解效果。突变酶在酶活,酶学性质及水解性能方面的差异可能主要是由氨基酸突变造成的。