自1998年拉米夫定应用于临床治疗慢性乙型肝炎以来,HBV对拉米夫定耐药性问题日益严重,耐药患者在接受新的核苷(酸)类似物药物治疗时更易产生耐药变异,如何更有效地进行抗病毒治疗成为人们共同关注的问题。本课题以拉米夫定耐药患者为研究对象,通过基因测序和点突变耐药试验研究YMDD基序以外HBV P基因结构和功能对拉米夫定疗效的影响,并进行长片段靶序列反向斑点杂交试验检测点突变条件探索,同时构建高复制拉米夫定耐药HBV全基因感染性克隆,为研究HBV的致病机制、耐药机制,及用于抗拉米夫定耐药HBV治疗药物筛选奠定基础。一、影响拉米夫定疗效的HBV基因结构与功能的研究及其应用1. HBV RT区序列与拉米夫定耐药相关性分析以29例对拉米夫定不同应答类型患者为研究对象,对治疗前后患者血清标本HBV多聚酶和逆转录酶区基因进行测序分析。从治疗前患者血清中检出YMDD变异株,但发现其不一定发展为临床耐药。首次报道了在B基因型HBV感染者中,逆转录酶A区rt91和B区rt164位点核苷酸具有多态性,其氨基酸在拉米夫定耐药株主要表现为rt91L和rt164V,在敏感株中主要为rt91I和rt164L,分布有显著性差异(P< 0.01)。rt91L和rt164V经拉米夫定选择成为反跳患者和无应答患者血清HBV的主要表型。此外,我们还发现在免疫压力下,存在由单一基因型发展为混合基因型感染的现象。2. Rt91和rt164位点变异与拉米夫定耐药关系的研究在HBV拉米夫定敏感株野生株#56质粒基础上,我们分别构建rt91、rt164和rt204位点单突变和联合突变质粒,转染HepGⅡ,进行拉米夫定耐药试验。rtL164V变异使B基因型HBV YMDD野生株对拉米夫定敏感性下降,rtI91L变异虽不直接改变野生株对拉米夫定的敏感性,但与rtL164V联合变异可进一步降低HBV对拉米夫定的敏感性。rt91和/或rt164位点的变异,显著提高B基因型YMDD野生株和YMDD突变株病毒复制能力(P<0.05)。3.反向斑点杂交试验检测拉米夫定耐药相关变异位点以Biotin标记反向引物扩增HBV逆转录酶区,与尼龙膜上寡核苷酸探针杂交,并与P基因测序法比较。rt91位点反向斑点杂交法与测序法完全符合率为82.6%[(13+5+6)/29],误判率6.9%[(1+1)/29];rt164位点符合率89.7%[(16+10)/29],误判率3.4%(1/29);rt204位点符合率75.9%[(12+6+4)/29],误判率3.4%(1/29)。总体符合率82.8%,总体误判率4.6%。结果表明,长片段靶序列反向斑点杂交可用于HBV耐药基因多位点变异检测。二、高复制HBV拉米夫定耐药感染性克隆株的建立从拉米夫定治疗无应答患者血清标本中扩增HBV全基因组,构建7株全长HBV基因克隆,通过磷酸钙转染HepGⅡ细胞和拉米夫定耐药试验,首次在国内筛选到一株具有高复制能力、拉米夫定耐药HBV B基因型全基因克隆。序列分析表明,该株病毒发生YIDD变异,但并未发生rtV173L、rtL180M等已知可提高HBV复制能力的突变,逆转录酶保守区和HBV调控区序列也未见明显变异,推测可能是基因位点变异后导致逆转录酶空间结构改变,使病毒复制能力增强。