论文部分内容阅读
在漫长的驯化选择过程中,十字花科芸薹属芸薹种形成了一系列具有不同形态的变种,如白菜、大白菜、菜心、芜菁等,其中,芜菁膨大的肉质直根是芸薹种十分重要的农艺性状之一,是研究植物贮藏器官形成的一个典型的模型。此外,芜菁还具有很高的经济、营养和药用价值,因此了解芜菁肉质直根发育和形成的分子机制对加速芜菁产量、品质和营养价值的遗传改良至关重要。本研究以芜菁‘温州盘菜’（Wenzhoupancai,WZPC）为母本,白菜‘苏州青’（Suzhouqing,SZQ）为父本构建F2分离群体,从F2分离群体中筛选出具有最大根直径和最小根直径的单株各25株,单株提取DNA并进行等量混合以构建根直径最大的极大池和根直径最小的极小池,对两个亲本样品和两个极端池样品分别进行高通量测序,鉴定芜菁直根膨大相关数量性状座位（quantitative trait locus,QTL）。以不同根型的芸薹种蔬菜DNA为模板,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,对QTL区间候选基因进行序列分析,并采用生物信息学分析和序列分析的方法来缩小候选区间的大小与候选基因的范围。通过转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）,对8 DAS（播种后天数,days after sowing）、32 DAS和70 DAS的WZPC下胚轴进行高通量测序,鉴定差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,并对DEGs进行生物信息学分析,结合实时荧光定量PCR（quantitative Real Time PCR,qRT-PCR）验证测序结果的准确性,对QTL-seq和RNA-seq数据进行联合分析进一步筛选芜菁直根膨大相关基因。最后,对筛选到的两个候选基因HAC1和IPT5进行了表达分析及功能的验证,取得主要结果如下:（1）定位到两个芜菁直根膨大相关QTL,分别位于2号染色体（10.13 Mb）和10号染色体（3.89 Mb）上。根据SNP和InDel功能注释信息和GO注释信息,筛选出位于2号染色体QTL上的31个候选基因和位于10号染色体QTL上的33个候选基因。对以上64个候选基因进行序列分析,结果表明HAC1和IPT5这两个基因的结构变异可能和功能变异相关联。（2）对8 DAS、32 DAS和70 DAS WZPC下胚轴进行RNA-seq,对三组表达数据进行两两比较,即8 DAS与32 DAS（S1 vs S2）、32 DAS与70 DAS（S2 vs S3）,以及8 DAS与70 DAS（S1 vs S3）。在S1 vs S2中筛选出了3774个DEGs,其中1527个基因在S2上调表达,2247个基因下调表达;在S2 vs S3中筛选出了5524个DEGs,其中2283个基因在S3上调表达,3241个基因下调表达;在S1 vs S3中筛选出了7225个DEGs,其中2533个基因在S3上调表达,4692个基因下调表达。对10个随机挑选的DEGs进行表达量的qRT-PCR分析,发现基因表达变化趋势和转录组测序结果一致,证明RNA-seq数据可靠。对转录组数据和QTL-seq数据结果进行联合分析,得到2号染色体候选基因和转录组差异表达基因的共同基因306个,得到10号染色体候选基因和转录组差异表达基因的共同基因197个。（3）利用qRT-PCR技术,检测并比较HAC1和IPT5在WZPC和SZQ 8 DAS、16 DAS、24DAS和32 DAS的下胚轴中的表达情况,发现IPT5和HAC1在WZPC和SZQ不同发育时期的下胚轴中均有不同程度的表达,两者均在直根膨大初期即16 DAS的WZPC下胚轴中表达升高至最高水平,说明IPT5和HAC1可能参与WZPC直根膨大的起始和发育。（4）对白菜参考基因组、WZPC和SZQ中HAC1和IPT5的基因序列、启动子序列、以及蛋白质序列进行比对,利用网站PlantCare和SMART分别对HAC1和IPT5启动子元件和蛋白质结构域进行预测。结果发现,相较于白菜参考基因组,来自SZQ的IPT5基因序列共产生了17个SNP（单核苷酸多态性,single nucleotide polymorphism）（包括6个非同义突变）,HAC1基因序列共发生13个SNP以及3个InDel（插入或缺失,insertion/deletion）（包括2个非同义突变和1个移码插入）;相比于来自WZPC的HAC1启动子,来自SZQ的HAC1启动子缺少了包括AAAC-motif、ATCT-motif和G-Box在内的光响应相关启动子元件,这些光响应元件的缺失可能影响SZQ HAC1启动子的启动活性,导致SZQ HAC1表达水平发生变化;对蛋白质结构域进行预测,发现WZPC和SZQ中的IPT5和HAC1蛋白结构域高度一致。（5）对ipt5和hac1拟南芥纯合T-DNA插入突变体16 DAS和24 DAS的下胚轴解剖学结构进行观察,发现与野生型拟南芥相比,16 DAS时hac1下胚轴中柱鞘已形成较明显的形成层环,且木质部次生生长活跃,木质部占比为整个中柱鞘的一半,而此时ipt5下胚轴木质部也较明显;24 DAS时ipt5和hac1下胚轴木质部次生生长更加活跃,其中hac1下胚轴木质部占比可达二分之一左右,ipt5下胚轴木质部占比大于三分之一,而野生型拟南芥下胚轴木质部只约占中柱鞘三分之一。上述结果表明HAC1和IPT5可能通过调控维管束形成层活性和木质部次生生长,在芜菁直根发育过程中发挥作用。