胃癌在全球范围内发病率和死亡率一直居高不下,尤其在中国及东南亚国家。每年仅中国的发病人数和死亡人数就占到了全球总发病人数的一半以上。一直以来,胃癌的发病机制以及诊疗手段都是全球科学家的研究重点。2015年1月随着美国总统奥巴马在国情咨文中提出“精准医学”的概念,癌症作为主要的攻克对象,正在得到越来越多的关注。在区别于传统的治疗手段的基础上,目前针对胃癌的精准治疗,主要包括靶向治疗和生物免疫治疗等。靶向治疗,顾名思义,寻找并明确胃癌中与肿瘤进展相关的特异性靶点,针对这些靶点进行药物的设计与研发,使得药物进入人体后能够特异性地作用于靶基因,通过抑制靶基因的功能来阻断肿瘤的进展过程,从而达到治疗肿瘤的目的。生物免疫治疗的作用机制主要是借助免疫学的理论,例如构建特异性的免疫效应细胞进行靶向结合,特异性识别免疫逃逸的肿瘤细胞以及清除机体内具有强大免疫抑制作用的免疫细胞等。正常情况下,机体的免疫作用能够对异己成分或者不正常的细胞进行识别并清除,而肿瘤细胞能够在免疫监视作用下逃逸并且进行增殖,分化,形成肿瘤组织,进而通过上皮间充质转化以及游走于血液和淋巴系统定植于人体的多个部位。研究表明,肿瘤微环境中存在大量的免疫抑制细胞,能够释放强而有效的免疫抑制性的细胞因子,阻止T细胞等免疫细胞进行分化增殖,还能促使正常的免疫细胞分化成为免疫抑制细胞,从而产生强大的免疫抑制效应来对抗机体免疫的抗肿瘤作用。在胃癌精准治疗发展中,一方面在于寻找特异性靶点,对胃癌的早期临床诊断,后续的治疗以及预后提供依据;另一方面寻找干扰机体正常免疫功能的关键因素,进而通过恢复或者增强机体自身的免疫功能,从而达到治愈肿瘤的目的。本文针对胃癌进行了以下两方面的实验研究,旨在为胃癌的临床诊疗提供理论参考和实验依据。第一部分ANXA3在胃癌中的表达及作用机制的研究研究背景胃癌是世界范围内常见且高发的胃肠道恶性肿瘤,据国际癌症研究机构截止到2012年的数据统计,新增病例超过950,000人,因胃癌死亡人数超过720,000人。目前,胃癌已成为继肺癌,乳腺癌,结直肠癌和前列腺癌之后的全球第五大恶性肿瘤,其发病率和死亡率分别位于第5位和第3位。在东亚国家中,尤其在中国,胃癌的发病率以及死亡率更是高于其他国家数倍以上。虽然外科手术以及放化疗技术不断地发展,但胃癌患者的总生存期并没有得到显著提高。在我国由于胃癌患者初次发现多为中晚期,同时胃癌具有高转移性和复发率高等特点,以至于胃癌患者术后5年生存率仍低于30%。因此,在传统治疗方法之外,探寻影响胃癌发生发展的新的靶点极为重要,同时也为胃癌的早期筛查以及后续的靶向治疗提供依据。上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),是胚胎发育过程中必需的生理过程,越来越多的研究表明它与肿瘤的侵袭转移过程有着密切的联系。在肿瘤转移的初期,在基底膜附着的肿瘤细胞破坏了细胞间紧密和黏附连接,失去了上皮细胞所具有的极性,并获得了运动能力,通过蛋白酶的作用,游走进入细胞外基质。其主要特征表现为上皮细胞黏附分子(E-钙黏蛋白)和细胞骨架蛋白(角蛋白)的减少以及间充质细胞标志物(纤维连接蛋白,波形蛋白等)的增多。同时,EMT还参与了与肿瘤相关的多条信号通路的信号转导,例如,TGF-β,NF-Kb,RTK/Ras,Wnt/β-catenin 等。因此,EMT 在肿瘤的发生发展中起到了重要作用。膜联蛋白A3(Annexin A3,Anxa3)是膜联蛋白家族中的一员,位于人类常染色体4q13-q22,有33kDa和36 kDa两种亚型,也被称作脂皮质蛋白3(lipocortin3),或胎盘抗凝蛋白 3(placental anticoagulant protein3,PAP-Ⅲ)。ANXA3是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,其保守的C-末端结构域包含四个相似的保守膜联蛋白结构域Ⅰ-Ⅳ,每个结构域由5个α螺旋和大约70个氨基酸组成,只有在Ca2+存在的情况下才能与磷脂膜结合。N-末端结构域包含20个氨基酸残基,是膜联蛋白的高度可变区,参与调节以及与磷脂膜的结合。研究发现,ANXA3在多种恶性肿瘤中发挥着重要作用,但在胃癌中的研究甚少。2014年,Zhai等通过免疫组化实验发现ANXA3在胃癌组织中高表达并与肿瘤大小和TNM分期相关,与预后呈负相关,但未对ANXA3在胃癌中的功能进行更深一步研究,因此,我们结合既往研究推测ANXA3有望成为胃癌治疗的靶点以及早期诊断的标志物。目前已经发现ANXA3在多种恶性肿瘤中存在异常表达并影响肿瘤的进展,例如在甲状腺癌和前列腺癌中ANXA3表达降低,表现出抑癌基因的作用;而在肺癌,常见的女性生殖系统肿瘤(卵巢癌和乳腺癌)以及常见的消化道肿瘤(直肠癌、肝癌和胰腺癌)中研究均证实其表达升高,能够促进肿瘤的转移和血管的生成,同时还增加了肿瘤的耐药性,说明在这些恶性肿瘤中ANXA3发挥了原癌基因的作用。然而对于ANXA3在另一种常见消化道肿瘤一胃癌中的表达情况及作用机制鲜有报道。研究目的本研究从临床标本,体外实验和体内实验三个层面来探讨ANXA3在胃癌中的表达,以及对胃癌发生发展和预后的影响;通过探寻ANXA3对胃癌EMT过程的影响,进而阐明ANXA3促进胃癌转移的作用机制,为胃癌的诊疗及预后寻找新的靶点。研究方法1.通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qPCR)及蛋白印迹法(western blot)分别检测ANXA3在胃癌细胞系及组织中mRNA和蛋白水平的表达;运用免疫组化的方法检测ANXA3在183例胃癌组织中的表达情况,结合患者的临床病理资料进行统计分析,探明ANXA3的表达水平是否与胃癌的临床病理特征及预后具有密切联系。2.干扰以及过表达ANXA3,通过平板克隆实验以及Transwell实验来检测ANXA3对胃癌增殖,以及侵袭、迁移能力的影响;选用shRNA-ANXA3稳定转染的SGC7901细胞株进行裸鼠皮下成瘤实验,对比转染前后瘤体体积和重量的变化,明确ANXA3对胃癌发生发展的影响。3.通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qPCR)及蛋白印迹法(western blot)检测干扰 ANXA3 后对 EMT 标志物(E-cadherin,Vimentin,fibronectin 和β-catenin)以及转录因子(snail和slug)表达影响。研究结果1.通过对胃癌细胞和胃癌组织mRNA以及蛋白水平表达的检测,发现ANXA3在胃癌细胞中表达明显高于正常胃粘膜上皮细胞,在胃癌组织中表达显著高于相应的癌旁组织。免疫组化实验根据染色评分将183例胃癌组织分为两组,ANXA3高表达组(105例)和低表达组(78例),结合相关临床病理指标分析发现,高表达组与肿瘤大小(P=0.006),浸润深度(P<0.001),TNM分期(P<0.001),局部淋巴结转移(P=0.023)和远处转移(P=0.014)有明显相关性。Kaplan-Meier生存分析显示,在ANXA3低表达的病人中,能够获得更高的总体生存率和无病生存率(P<0.001);同时单变量及多变量分析显示病人的总体生存率与ANXA3的表达,肿瘤浸润深度,TNM分期,局部淋巴结转移,远处转移等都具有明显相关性,但与病人的年龄,性别无明显相关性。2.通过细胞实验,对高表达ANXA3的MKN45和SGC7901细胞进行干扰,对低表达的HGC27和MGC803细胞进行过表达发现,干扰ANXA3表达的胃癌细胞增殖和侵袭迁移能力较对照组明显减弱,而过表达ANXA3则能明显促进胃癌细胞的增殖和侵袭迁移。动物实验中,干扰表达的SGC7901细胞较对照组,肿瘤的体积与重量都有明显下降。3.在干扰表达ANXA3的MKN45和SGC7901细胞实验组中,通过western blot检测发现EMT相关上皮标志物E-cadherin表达减少,间质标志物Vimentin,Fibronectin和β-catenin表达增加,同时相关转录因子Snail和Slug蛋白表达均增加;qPCR检测发现,ANXA3的表达与E-cadherin的表达成负相关,与Vimentin的表达呈正相关,提示ANXA3促进了胃癌的EMT过程,加速了肿瘤的转移。研究结论1.ANXA3在胃癌细胞及组织中均高表达,且与肿瘤的大小,TNM分期,淋巴结转移,远处转移呈正相关,与预后及生存率呈负相关。2.在体外实验中,过表达ANXA3能够促进肿瘤的增殖,侵袭和迁移;在体内实验中,干扰表达ANXA3能够减慢肿瘤的生长,说明ANXA3参与并加速了肿瘤的发展。3.干扰ANXA3的表达使得E-cadherin的表达上调,Vimentin等表达下调,提示干扰ANXA3表达后,肿瘤的EMT过程受到了抑制。说明ANXA3能够加速肿瘤的EMT进程,促进肿瘤的转移。以上结论提示ANXA3可能成为胃癌诊断、治疗以及预后判断的新的靶点。第二部分外周血中IL-35+ B细胞的分布与胃癌关系的初步研究研究背景胃癌的高复发率和高死亡率一直是影响胃癌治疗的关键因素,患者初次诊断为胃癌多为进展期,在传统治疗手段受到局限的同时,新的治疗方法作为常规治疗的有效补充,能够使患者的术后生存期得到延长,预后得到改善。生物免疫治疗作为目前精准治疗方法的一种,正逐渐得到人们的认可,大多数研究以及治疗方案都集中在T淋巴细胞,NK细胞,DC细胞等免疫细胞,对于B淋巴细胞在恶性肿瘤中的免疫研究相对较少。B淋巴细胞作为人们所熟知的免疫细胞,在体液免疫中,当B细胞受到抗原刺激时,能够分化成为浆细胞分泌抗体,直接作用于抗原;而在细胞免疫中,B细胞同时能够作为抗原呈递细胞,将抗原呈递给T细胞等免疫效应细胞发挥免疫调节作用。随着对免疫细胞的研究不断深入,研究者们发现了一群具有很强免疫抑制功能的T细胞亚群—调节性T细胞(Treg细胞),随后发现在B淋巴细胞中,同样也存在一群能够分泌IL-10,TGF-β等免疫抑制性细胞因子的细胞,功能及作用与调节性T细胞相类似,目前把这一群能够分泌IL-10等免疫抑制性细胞因子的B细胞暂称为调节性B细胞(Breg细胞)。IL-35作为IL-12家族的一员,由p35和EBi3两个亚基构成。目前对于IL-35的研究多集中在由Treg细胞产生并分泌,能够在多种自身免疫性疾病,炎症性疾病以及人类多种的恶性肿瘤中发挥免疫抑制作用。最近研究发现,在B细胞中同样存在一群能够分泌IL-35的免疫抑制细胞(IL-35+ B细胞),这群细胞相对于分泌IL-35的Treg细胞的报道较为少见,然而在胃癌中的研究更是鲜有报道。研究目的针对IL-35+ B细胞与胃癌以及其他免疫抑制细胞之间关系目前尚不清楚。我们采用流式细胞术的方法检测并分析了胃癌患者和正常人外周血中IL-35+ B细胞的分布以及与胃癌分期的关系,同时还分析了 IL-35+ B细胞与外周血中各免疫细胞亚群之间的相互联系。研究方法1.收集胃癌患者(50例)和正常人(30例)的外周血,在外周血中加入标记抗体,4℃避光孵育20min后裂解红细胞,再用PBS洗涤后上机检测;2.对胃癌患者的外周血进行单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的分离,加入细胞刺激剂和高尔基体阻断剂(CpG(ODN2006)和GolgiPlugTM),37。℃,5%CO2培养箱中刺激培养,PBS洗涤后加入标记抗体上机检测;3.采用流式细胞术的方法在胃癌患者以及正常人的外周血中检测并分析IL-35+B细胞的分布与胃癌分期的相关性;同时还检测了外周血中髓系来源的免疫抑制细胞(MDSCs)和Treg细胞的分布与胃癌分期及IL-35+B细胞分布的相关性;最后检测了 CD4、CD8细胞,活化CD4、CD8细胞,记忆CD4、CD8细胞,以及NK细胞,CD14+单核细胞和IL-10+B细胞的分布,并分析了其与IL-35+B细胞分布的相关性。研究结果1.在胃癌患者外周血中,随着胃癌分期越高,IL-35+B细胞分布频率越高,在IV期患者中分布最多,且与其他各组间有明显统计学差异(P<0.001);2.在胃癌患者外周血中,随着胃癌分期越高,MDSCs和Treg细胞分布频率越高,其中在IV期患者中分布最多,同时与IL-35+ B细胞分布频率有明显相关性;3.检测外周血中CD4、CD8细胞,活化CD4、CD8细胞,记忆CD4、CD8细胞,以及NK细胞,CD14+单核细胞和IL-10+B细胞的分布情况,其中CD14+单核细胞和IL-10+ B细胞所占百分比与IL-35+ Breg细胞所占百分比呈明显正相关(p<0.05),其余各组间无明显统计学差异。研究结论在胃癌患者外周血中IL-35+B细胞,MDSCs和Treg细胞分布频率增高,且与胃癌的分期显著相关,同时IL-35+B细胞还与MDSCs,Treg细胞,CD14+单核细胞和IL-10+ B细胞的分布频率呈正相关,提示在胃癌中IL-35+ B细胞起到免疫抑制作用,推测其可能通过招募,调节其他多种免疫细胞发挥协同免疫抑制作用,从而加速了胃癌的进展。