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目的： 本研究通过比较肝癌转移患者与未转移患者的肝癌组织铁含量，以及体内外实验明确缺铁与肝癌转移的关系和机制，为系统了解肝癌铁代谢特点及其在肝癌细胞转移中的作用，同时为今后肝癌转移防治措施的完善，尤其是铁螯合剂在肝癌治疗中的应用提供科学依据。 方法： 一、肝癌组织铁含量的检测 1.磁共振成像检测铁含量 采用GE Signa HDx1.5T MR扫描仪对肝癌患者进行术前扫描，按设定参数扫描后利用自带的工作站软件建立R2*图，随后在R2*图手动标出目标区域，通过软件分析得到R2*值。 2.火焰原子吸收法检测组织铁含量 剪下适量组织，烘干后称重，置于玻璃消化管中，加入1ml硝酸和高氯酸混合酸（硝酸/高氯酸=1/4）。放入高温消化炉消化至组织溶解，溶液澄清，随后定容至10ml，作为待测液。以铁标准贮备液(100μg/mL)为标准品配置标准曲线测定液，随后与待测样本同时进原子吸收分光光度计检测，根据标准曲线计算出溶液中铁含量，再比上各组织重量得到组织中铁含量(μg/g)。 二、细胞实验 1.细胞培养与处理 Huh7细胞和HepG2细胞培养于含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养液中，SMMC-7721细胞和H22细胞培养于含10％胎牛血清和1％双抗的RPMI-1640培养液中。DFO的使用浓度为100μM，Dp44mT的使用浓度为10μM，处理时间为24小时。HIF1α抑制剂PX478的使用浓度为20μM，SP1抑制剂Mithramycin A的使用浓度为100nM，在添加铁螯合剂的同时加入培养液中。 2.原代肝细胞提取 人原代肝细胞购于Sciencell公司并附鉴定报告。小鼠原代肝细胞提取:消化酶灌流后取出肝，重悬细胞过400目筛网过滤，随后通过Percoll分离液分离细胞，转移细胞至细胞培养瓶培养并洗去未贴壁细胞。 3.细胞增殖检测 采用ThermoFisher Click-iT(@)Plus EdU Alexa Fluor(@)488Flow Cytometry Assay Kit检测细胞增殖。 4.细胞迁移侵袭实验 采用transwell小室定性检测肝癌细胞迁移能力，采用Cell Biolabs迁移能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞迁移能力变化。侵袭能力定性检测采用预包被基质胶的transwell小室，采用Cell Biolabs侵袭能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞侵袭能力变化。 5.细胞转染 采用lipo3000进行siRNA转染，siRNA浓度为100μM，lipo3000用量及操作参照试剂说明书，隔天换液，转染48小时后进行后续操作。 6.荧光素酶标记 细胞荧光素酶标记使用荧光素酶标记试剂盒（上海中乔新舟，货号A1001-8），该试剂盒内含慢病毒介导的萤光素酶标记液及辅助感染的polybrene，通过CAG启动子过表达萤光素酶从而作为报告基因，感染后可在细胞中稳定表达。 7.细胞TFRC基因敲降 使用携带TFRC shRNA的慢病毒敲降Huh7细胞和H22细胞的转铁蛋白受体，将shRNA序列克隆进pLVX-shRNA1慢病毒载体后进行包装和生产，得到病毒感染液后感染细胞并筛选稳定细胞系进行后续成瘤实验。 8.荧光淬灭法检测细胞内铁含量 使用Phen GreenTM FL试剂(Thermo Fisher)检测细胞内铁含量。细胞内二价铁与荧光试剂结合使其荧光淬灭，通过荧光显微镜观察细胞内荧光强度定性检测细胞内铁含量的变化。 9.转录因子活性芯片 DFO干预Huh7细胞24h后提取核蛋白，与对照组核蛋白一起分别与TranSignalTM Protein/DNA Array试剂盒中345种特异性与转录因子结合的探针孵育结合，随后洗去未结合的探针，接着分离探针/核蛋白复合体得到探针，与transignal芯片杂交，检测每种探针产生的信号变化，以此反应各探针对应的转录因子结合活性的变化。 10.染色质免疫共沉淀 采用CST的酶解法染色质免疫共沉淀试剂盒检测三种转录因子HIF1α、SP1和YY1对SPNS2转录活性的变化 。 结果： 一、肝癌转移患者癌组织铁含量显著低于未转移患者 1.与正常组织或癌旁组织相比，肝癌组织铁含量下降 10例肝癌患者肝癌组织的R2*值显著低于癌旁组织和远处正常肝组织的R2*值。由于R2*值与铁含量呈正相关，提示肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。 火焰原子吸收法定量检测29位肝癌患者手术标本癌旁组织和癌组织，发现肝癌组织铁含量显著低于癌旁组织，与磁共振扫描的结果一致。 与癌旁组织相比，肝癌组织铁稳态分子TFRC、HAMP、Ferritin的表达显著改变，符合肝癌组织缺铁的表现。上述结果表明，肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。 2.发生转移肝癌患者的癌组织铁含量显著低于未发生转移肝癌患者 收集术后5年内发生转移复发的肝癌患者15例，未发生转移复发患者15例，通过检测手术标本（5年前首次手术的标本）的铁含量及铁稳态分子表达，发现发生转移的肝癌患者其肝癌组织铁含量显著低于未发生转移的肝癌患者，提示铁含量下降在肝癌转移中可能发挥一定作用。 二、体内外实验证实缺铁促进肝癌细胞转移 1.缺铁抑制人肝癌细胞增殖，但促进人肝癌细胞迁移和侵袭 通过添加DFO(100μM)和Dp44mT(10μM)两种铁螯合剂造成细胞缺铁模型。采用EdU标记方法观察缺铁对三种人肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721增殖的影响，结果发现缺铁时三种肝癌细胞增殖均受到显著抑制。 但是，定性及定量检测结果显示，在两种铁螯合剂的作用下，Huh7、HepG2、SMMC-7721三种肝癌细胞均表现出显著的迁移侵袭增强。 2.缺铁促进人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内转移 2.1系统性缺铁模型 在体内缺铁是否促进肝癌转移尚不清楚。首先通过给裸鼠喂食缺铁饲料造成裸鼠系统性缺铁模型，观察人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内的转移情况。通过检测肝组织、肺组织铁含量和血清铁含量、铁蛋白含量、转铁蛋白饱和度等指标以及免疫荧光检测肝组织、肺组织的铁蛋白表达，确认喂食缺铁饲料后裸鼠缺铁模型制作成功。 为了更好地观察肝癌细胞在体内转移的情况，采用活体成像技术定期观察肝癌细胞在体内的生长、扩散。Huh7细胞进行荧光素酶标记(Huh7-fluc)，扩增到足够数量后通过肝脏原位种瘤和尾静脉注射种瘤两种方式进行体内荷瘤实验。每10天进行一次活体成像拍照，并利用软件分析肝癌细胞在体内的增殖数量与转移面积。结果发现，与正常组相比，在两种荷瘤模型中缺铁组均表现出明显的肝癌细胞转移范围增大和肺部转移增强。提示缺铁会促进Huh7细胞的体内转移。 2.2肝癌细胞(Huh7)缺铁模型 为了更贴合人肝癌组织铁含量下降而整体并不缺铁的情况，通过敲降Huh7细胞转铁蛋白受体，限制其摄入铁的能力而造成细胞内缺铁。检测TFRC mRNA表达和TfR1蛋白表达显示，敲降Huh7-fluc细胞TfR1成功，同时细胞内铁含量低于未敲降组。 Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞与Huh7-fluc细胞扩增足量后以同样细胞量通过原位种植和尾静脉注射两种方式进行裸鼠荷瘤实验，敲降组与未敲降组裸鼠喂食同样的正常饲料。相比于Huh7-fluc细胞，Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞在裸鼠体内转移显著增强，肺部转移显著。 3.缺铁促进小鼠肝癌细胞H22在C57小鼠体内转移 系统性缺铁模型 为了排除免疫系统缺陷对肝癌细胞转移的影响，在C57小鼠体内种植小鼠肝癌细胞H22，观察缺铁对H22在体内转移的影响。通过检测铁相关指标，确认喂食缺铁饲料后C57小鼠系统性缺铁。 同样，H22细胞标记荧光素酶（H22-fluc）后，以肝原位种瘤和尾静脉注射两种方式荷瘤。活体成像拍照分析结果显示缺铁组小鼠比正常组小鼠成瘤面积大，肺部转移肿瘤面积增大。 结论： 本研究通过检测肝癌转移患者和未转移患者癌组织铁含量，并在整体和细胞水平制作多种缺铁模型，观察缺铁对肝癌细胞转移的作用及其机制。从所取得的实验结果上得出以下结论: 1.发生转移肝癌患者癌组织铁含量明显降低; 2.在体内和体外，缺铁均促进肝癌细胞转移; 2.SPNS2上调是缺铁促进肝癌细胞转移的关键环节; 3.HIF1α和SP1在缺铁引起SPNS2上调中发挥重要作用。