茶氨酸是茶叶中的特征氨基酸,也是茶叶的呈味物质之一。它是一种具有多种生理效应的特殊氨基酸,在食品添加剂方面已有广泛应用,在功能食品方面崭露头角,在医药方面有待开发,市场潜力巨大。已报道的茶氨酸制备方法中,微生物转化法是一种发展前景较好的茶氨酸制备方法。开展茶氨酸的微生物酶法合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本研究的主要目的是选择地衣芽孢杆菌作为合成茶氨酸的产酶菌株,并结合种间耦联ATP再生技术系统用于酶法合成茶氨酸等进行研究,为利用微生物发酵法工业化生产茶氨酸打下基础。主要研究结果如下:1.产酶菌种:本实验采用γ-谷氨酰基转肽酶工业生产菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为生成茶氨酸的产酶菌种。产酶发酵研究表明,此菌株经产酶发酵后的γ-谷氨酰转肽酶活性可达6.33U/ml。2.茶氨酸转化试验结果:地衣芽孢杆菌的γ-谷氨酰基转肽酶具有较好的催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力。酶法合成茶氨酸的产量为21g/L。谷氨酰胺转化生成茶氨酸的转化率达35.2%。3.产酶促进剂研究结果:在常规产酶发酵研究基础上,研究了一些产酶促进剂对产酶发酵和茶氨酸转化的影响。正交试验结果显示,在产酶发酵培养基中添加磷酸吡哆醛、金属离子Mg2+、Mn2+和表面活性剂Tween-80可有效地提高地衣芽孢杆菌的产酶能力。γ-谷氨酰基转肽酶的活性可达7.42U/ml,酶法合成茶氨酸的产量为26g/L。谷氨酰胺转化生成茶氨酸的转化率达43.6%。4.种间耦联ATP再生技术研究结果:本研究将地衣芽孢杆菌的产酶系统和嗜热脂肪芽孢杆菌ATP供能系统相耦联建立了一种种间藕联ATP再生技术生产茶氨酸。采用该技术进行茶氨酸转化生产,茶氨酸产量达到35g/L,谷氨酰胺转化为茶氨酸的转化率为59%。5.固定化细胞技术生产茶氨酸研究结果:高活性的γ-谷氨酰基转肽酶产酶菌株地衣芽孢杆菌经产酶发酵后,用3%卡拉胶于45℃包埋,制备成γ-谷氨酰基转肽酶固定化细胞。将固定化细胞产γ-谷氨酰基转肽酶系统与ATP供能系统耦联后,在催化底物转化生成茶氨酸的同时实现被消耗的ATP再生,使茶氨酸合成反应高效率地进行。种间耦联固定化细胞合成茶氨酸的产量为30 g/L,谷氨酰胺转化生成茶氨酸的转化率为50.3%。本实验所选用的地衣芽孢杆菌为γ-谷氨酰基转肽酶的工业化生产菌株,具有较高的酶活性,该酶用于茶氨酸转化生产具有实用价值。本实验研究所建立的种间耦联ATP再生技术方法,不仅可用于茶氨酸的生产,还可以为其它酶工程发酵产品的生产提供技术支持。本实验还采用了固定化细胞技术生产茶氨酸,该技术的应用有利于工业化生产的操作和提高茶氨酸产品质量。本实验的所有研究为工业化生产茶氨酸提供了一条有价值的技术路线。