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细胞衰老(cellular senescence)是细胞进入一种周期不可逆转的停滞而达到的相对稳定状态。细胞衰老主要受到p53-p21通路和p16-pRb通路的调控,当这两条通路中的关键调控因子如p21蛋白表达下降或细胞周期蛋白cyclinD的蛋白表达上调时,细胞可以延缓衰老或绕过衰老程序继续增殖。miR-17家族,亦可称为miR-106b家族,是由6个序列相似,结构相仿,种子区序列相同(AAAGUGCU),物种间高度保守的成熟体miRNA组成。miR-17可以通过调节转录调控因子E2F家族和pRb蛋白水平的表达,进而调控细胞周期来影响细胞的增殖生长,提示miR-17在细胞衰老中发挥重要作用。但是miR-17上游和下游的调控因子和机制还不十分明确。因此研究miR-17调节细胞衰老的作用与机制,对于研究和治疗衰老相关疾病,探索肿瘤发生和发展的分子机理有着重要意义。研究目的：1.人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts, HFF)体外分离培养、生长与传代并观察各代HFF的增殖规律和特点。2.研究miR-17对HFF细胞衰老的影响。3.明确miR-17对HFF细胞周期的调节。4.研究miR-17对HFF细胞周期相关蛋白的调控作用。研究方法：1.无菌取7岁患者的手术切除的包皮,利用DispaseⅡ酶消化的方法获得较高纯度的HFF,并进行传代培养。取第3代HFF,用兔抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体作为一抗,采用免疫组织化学SABC法对细胞进行鉴定。2.慢病毒感染HFF 72h后,荧光倒置显微镜观察HFF-miR-17及HFF-NC细胞中GFP的表达,并拍照。利用实时定量PCR技术检测HFF-miR-17及HFF-NC中miR-17的表达情况。3.通过CCK-8法观察HFF-miR-17和HFF-NC生长变化,并绘制细胞增殖曲线。衰老相关p-半乳糖苷酶染色法检测HFF-miR-17和HFF-NC细胞中衰老相关p-半乳糖苷酶的表达情况。4.利用流式细胞术检测HFF-miR-17与HFF-NC细胞周期的变化情况。利用Western blotting检测,空白对照细胞HFF、阴性对照细胞HFF-NC和实验组细胞HFF-miR-17中p21和cyclinDl蛋白表达水平。研究结果：1.采用SABC法对细胞行免疫化学染色,实验组用兔抗人波形蛋白单克隆抗体作为一抗,显微镜下观察可见,细胞呈长梭形或多角形,细胞胞浆呈棕色染色,提示其为HFF细胞。2. 慢病毒感染HFF 72h后,荧光显微镜下检测到绿色荧光分布于细胞内,与光学显微镜下同一视野对比,荧光示感染效率达90%,提示感染成功。慢病毒感染HFF 72h后,利用实时定量PCR技术检测到感染了Lenti-miR-17的细胞与感染了Lenti-NC的细胞相比,miR-17表达明显上调,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。3.通过CCK-8法观察HFF细胞生长的变化。与阴性细胞HFF-NC相比,稳定表达miR-17的HFF-miR-17细胞在450nm处的吸光度值连续六天均明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05),表明miR-17能够促进HFF细胞的增殖能力。4.对细胞进行衰老相关p-半乳糖苷酶染色,HFF-miR-17细胞显示出较弱的衰老相关p-半乳糖苷酶染色,不到1%的细胞被染成蓝色,提示此时细胞为正常细胞；而对照细胞HFF-NC中有高达20%的细胞被染成蓝色,表明细胞已衰老,提示miR-17的表达显著抑制了细胞的衰老。5.利用流式细胞术检测细胞周期,结果显示HFF-miR-17细胞与对照HFF-NC相比,停滞在G1期的细胞明显减少(81.5% vs 72.6%)；用DNA破坏物质Bleomycin处理细胞后,72.9%的HFF-NC细胞停滞在G1期,仅有2.5%的HFF-NC细胞能够越过G1期进入S期,而HFF-miR-17细胞停滞在G1期的比例显著减少(54.6%),进入S期的增多(10.2%),说明miR-17促进细胞进入S期进行增殖且能越过药物诱导的G1 arrest。另外所有流式结果图中均没有出现凋亡峰,说明miR-17不是通过抑制细胞的凋亡促进细胞增殖的。6. Western blotting检测显示,与空白对照HFF细胞和阴性对照细胞HFF-NC相比,p21蛋白表达水平在HFF-miR-17中下调,而cyclinD1蛋白表达水平显著升高,说明miR-17能够通过调控p21和cyclinD1蛋白表达水平,促进原代细胞的增殖,抑制原代细胞的衰老。研究结论：1.利用Dispase Ⅱ酶消化的方法能获得较高纯度的HFF,并首次用慢病毒感染系统成功构建了在人包皮成纤维细胞中稳定表达miR-17的细胞系。2.miR-17能够抑制HFF细胞的衰老。3.miR-17能够促使HFF由G1期进入S期,促进细胞的增殖。4.miR-17能够调控HFF中p21和cyclinD1蛋白表达水平,促进原代细胞的增殖,抑制原代细胞的衰老。