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一直以来,裸卵因其体外成熟后胞质质量差、发育能力低得不到广泛运用。卵母细胞在高水平环磷酸腺苷(cAMP)抑制作用下发生减数分裂阻滞,延长胞质成熟时间,提高胞质成熟质量。胞质成熟达到一定水平后,cAMP下降,成熟促进因子(MPF)上升,使得质核成熟同步,有利于卵母细胞后期发育。本试验利用药物添加培养的方式模拟卵母细胞在体内成熟的机制,旨在建立小鼠裸卵体外成熟培养体系。通过统计成熟率,鉴定成熟卵母细胞质量,统计孤雌激活率、囊胚率,体外受精率、囊胚率,囊胚质量鉴定,荧光定量PCR检测基因表达的方法,观察本试验所建立的裸卵体系的效率,进而判定该裸卵成熟体系建立的可行性。本研究分为以下两个部分：试验一:GV期小鼠自然裸卵在不同浓度的cAMP激动剂forskolin培养液中培养不同时间段(3 h,12 h,24 h),之后转移至普通培养液中分别进行不同时间段的普通培养(21 h,12 h,0 h)。正交试验结果显示,GV期裸卵在10、50、100μM forskolin浓度下培养3 h,之后转移至普通培养液培养21 h,成熟率分别为：54.17±4.88%、50.83±4.84%、54.17士4.02%；GV期裸卵在10、50、100μM forskolin浓度下培养12 h,之后转移至普通培养液培养12 h,成熟率分别为：48.75±5.66%、74.50±5.39%、50.25±5.90%；在10.50、100μM forskolin浓度下培养24 h,成熟率分别为62.066.15%、49.17±4.58%、55.75±4.38%,forskolin 3 h,50μM条件下所得成熟率最高(P<0.05)。经纺锤体荧光染色检验证实,成熟裸卵纺锤体形态良好。不过,其所得成熟裸卵无法进行后期孤雌激活、体外受精的胚胎技术操作,孤雌或受精后卵母细胞碎裂。试验二：GV期小鼠自然裸卵在50μM forskolin浓度下分别培养不同时间段(3 h,12 h),之后转移至不同浓度的PD166285(MPF激动剂)培养液中,分别培养不同时间段(21 h,12 h)。试验结果表明,在不同培养方式下裸卵成熟率的组间差异不明显(P>0.05)：forskolin 3 h下,转至2.5、5、10μMPD 166285培养液中培养21 h,成熟率分别为76.71±4.11%、62.50±12.5%、85.00±2.14%;forskolin 12 h下,转至2.5、5、10μMPD 166285培养液中培养12 h,成熟率分别为72.60±2.10%、74.2-8.00%、73.72±4.21%。成熟裸卵经纺锤体荧光染色检验,纺锤体形态良好。后期胚胎操作孤雌激活试验中,forskolin 3 h下,转至2.5、5、10μM PD 166285培养液中培养21 h成熟裸卵孤雌后囊胚率分别为：18.33±4.44%、9.23±±5.82%、3.03±1.03%；在forskolin12h下,只在PD 1662852.5 μM条件下所得成熟裸卵顾伺候产生囊胚,孤雌囊胚率为2.53±2.00%。经细胞总数免疫荧光染色技术统计后,证明囊胚内细胞团/细胞总数比值为32.39±5.20%,与对照组无显著差异。此外,在后期胚胎操作体外受精试验中,只有在3 h forskolin培养后,转移至2.5μMPD 166285浓度下培养21h所得成熟裸卵,体外受精后能够产生囊胚,囊胚率为5.65±3.10%,囊胚质量良好。检测MPF相关基因cyclin B1 (Ccnb1)、cyclin O (Ccno)表达发现,Ccnbl和Ccno在forskolin 3 h培养后转移至PD1662852.5μM条件下所得成熟裸卵中,表达量最低。同时,检测抗凋亡基因Bax表达发现,Bax在此条件下同样表达量最低。综上所述,本研究建立了通过添加剂体外培养裸卵,获得功能性成熟小鼠裸卵的裸卵体外成熟体系。在该体系下,GV期小鼠自然裸卵先于50ìM浓度的forskolin培养液中培养3 h,之后转移至2.5州浓度的PD166285培养液中培养21 h,所得成熟裸卵能够进行孤雌激活和体外受精,并产生囊胚。