胸部肿瘤放疗过程中不可避免的会引起放射性肺损伤,并影响肿瘤放射剂量的提高,甚至造成治疗的中断,但其发病机理目前仍未完全阐明。本研究采用与人的解剖、生理及单次照射的剂量-效应曲线均较为接近的哺乳动物小型猪作为研究对象,从肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化、基质金属蛋白酶两方面着手,运用免疫荧光双染、蛋白免疫印迹、明胶酶谱、ELISA、Masson染色等实验方法,探讨小型猪放射性肺损伤发生发展的可能机制,并进一步探索肿节风对小型猪放射性肺损伤发挥防护作用的分子生物学机理。第一部分：肿节风对小型猪放射性肺损伤中EMT的抑制作用目的：通过研究小型猪放射性肺损伤过程中肺泡Ⅱ型上皮细胞发生间质细胞转化,探讨其在放射性肺损伤中的可能作用,并进一步探索肿节风放射防护作用的机理。方法：将60头雄性小型猪采用随机分组的方法随机分为空白组、单纯照射组(单照组)和肿节风+照射组(药照组)三个组,每组20头。在麻醉条件下对单照组和药照组采用60COY射线进行右胸单次15Gy的照射,空白组只麻醉不予照射；药照组于放疗前一周开始按照0.3g/kg的药量经口腔给予肿节风配方颗粒溶液,空白组和单照组予等量的生理盐水,直至实验结束。三个组分别于放疗后的4周、8周、12周及24周四个时间点随机抓取5头小型猪,予前腔静脉抽取静脉血后处死,取双肺；一部分肺组织于4%多聚甲醛中固定；一部分称重后分装,于-80℃冰箱保存待用,左右肺分开保存、固定。行HE染色观察肺组织的病理变化；免疫组织化学染色观察a-SMA蛋白的表达；免疫印迹检测SP-A、TGFβ1、vimentin和E-cadherin的蛋白表达；免疫荧光双染观察a-SMA和SP-A在肺泡上皮细胞的共表达。结果：1、肺脏大体形态：随着照射后时间的延长,单照组小型猪右肺可观察到水肿、充血,并可见散在的点状出血发展成大面积的出血灶,最终形成肺实变,而药照组中小型猪右肺的病变在各个时间点均较单照组减轻,在照射后24周时,右肺虽萎缩变小,但未见明显的实变病灶。2、HE染色：单照组小型猪照射后第4周肺组织以渗出性病变为主,主要表现为肺间质及肺毛细血管充血,间质水肿及较多炎性细胞浸润；随照射后时间的延长,渗出性病变进一步加重,并可见纤维性病变,至照射后12周肺组织则以纤维性病变为主,肺泡壁明显增厚,部分肺泡腔缩小或塌陷,肺泡间隔增宽伴融合,并可见较多的成纤维细胞,照射后第24周,肺实质内可见较多淡红色呈条索状、旋涡状分布的纤维素样病灶,还观察到明显的肺实变病灶形成。药照组中小型猪各个时间点的肺组织病理改变均和单照组相似,但程度有所减轻。3、肺组织a-SMA蛋白的表达情况：单照组肺组织a-SMA的蛋白表达从照射后4W即开始升高,并呈现逐步升高的趋势,且四个时间点和空白组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)；经肿节风干预后,药照组中a-SMA蛋白的变化趋势均不及单照组明显,与空白组和单照组比较,四个时间点的差异均有显著性(P<0.05)。4、肺组织SP-A、TGFPβ1、vimentin和E-cadherin的蛋白表达：照射后,单照组小型猪肺组织内TGFβ1和vimentin蛋白表达呈随时间递增的趋势,而SP-A和E-cadherin蛋白表达与其相反,呈时间依赖性下降,不同时间点和空白组相比,差异均有显著性(P<0.01)；而药照组内,四个蛋白的表达变化趋势和单照组相似,但其升高或下降的幅度变缓,在四个时间点,分别和空白组、单照组比较,均有显著性差异(vs空白组,P<0.01;vs单照组,P<0.05)。5、激光共聚焦扫描显微镜：在空白组,可观察到肺泡壁上有绿色荧光标记的SP-A表达阳性的细胞,肺泡间隔内可见少量红色荧光标记的a-SMA表达阳性的区域或细胞。在单照组,在照射后8W肺间质内可见较多红色荧光标记的a-SMA表达阳性的细胞,其间夹杂一定数量的绿色荧光标记的SP-A表达阳性的细胞；在照射后12W可见大量红色荧光标记的a-SMA表达阳性的细胞,而绿色荧光标记的SP-A表达阳性的细胞继续减少。经两种蛋白荧光组合定位技术融合后,在照射后8W肺间质内可见一些橙色标记的细胞,即a-SMA和SP-A共表达的细胞；药照组在相应时间点,SP-A表达阳性细胞较单照组多,a-SMA阳性表达的细胞数量较单照组少,且照射后8W肺间质内橙色标记的细胞数量也较少；而对照组中并未观察到橙色标记的细胞。结论：1、60COy射线对小型猪右胸单次15Gy的照射可以成功建立放射性肺损伤模型。2、小型猪放射性肺损伤的形成过程中,肺泡Ⅱ型上皮细胞获得了间质细胞的表型,即发生了上皮细胞向间质细胞转化,在一定程度上可促进放射性肺损伤的发展,加速肺纤维化的形成。3、肿节风通过下调TGFβ1和vimentin蛋白表达,上调SP-A和E-cadherin蛋白表达,减少肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化即抑制EMT来发挥放射性肺损伤的防护作用。第二部分：肿节风对小型猪放射性肺损伤中MMPs的抑制作用目的：研究在放射性肺损伤发生发展过程中MMP2和MMP9蛋白表达和酶活性的变化及可能作用,探讨肿节风通过对MMP2和MMP9的影响而发挥放射防护作用。方法：应用酸性水解法和Masson染色检测肺组织中胶原的含量,ELISA和Western blot检测MMP2和MMP9的蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP2和MMP9的酶活性变化。结果：1、Masson染色：单照组小型猪从照射后4W开始,胶原纤维较空白组稍有增加,随照射后时间的延长,胶原纤维聚集区域逐渐增多；至照射后12W,肺间质内胶原纤维明显增多,并见散在的纤维化病灶；在照射后24W,除肺纤维化病灶增加外,肺间质内还可见广泛分布的层状或旋涡状胶原纤维聚集区。药照组内肺组织纤维化程度相对较单照组轻。2、羟脯氨酸含量：单照组羟脯氨酸含量在照射后4W开始明显升高,药照组中羟脯氨酸含量同样呈升高趋势,但低于单照组含量,且四个时间点与单照组、空白组相比,差异均有显著性(P<0.01)。3、MMP2和MMP9含量：单照组小型猪肺组织中MMP2的含量在照射后4W开始升高,在12W有所回落,但仍高于空白组和药照组,且四个时间点和空白组、药照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)；药照组小型猪肺组织中MMP2的含量介于单照组和空白组之间。单照组内MMP9的含量在照射后也呈升高趋势,但其基础值偏低,在照射后24W明显升高；在照射后4W、8W和24W,单照组、药照组和空白组三组之间两两相比,P<0.01,照射后12W,药照组与空白组、单照组相比,P<0.05,空白组与单照组相比,P<0.01。4、MMP2和MMP9蛋白表达：单照组肺组织MMP2和MMP9的蛋白表达在照射后均呈现升高的趋势,在照射后12W其蛋白表达均有所回落,但亦高于药照组和空白组,且MMP9的基础表达亦较低,在照射后24W亦明显升高,这和ELISA检测出的结果相符。MMP2、MMP9的蛋白表达变化在不同时间点与,空白组、单照组和药照组三组之间两两比较,差异均有显著性(MMP2 P<0.01:MMP9除在照射后12W,P<0.05外,其余时间点,P<0.01)。5、MMP2和MMP9酶活性：单照组和药照组中MMP2、MMP9的酶活性在照射后均表现为逐步升高的趋势,仅药照组中增加的幅度较缓。单照组MMP2酶活性的变化从照射后8W开始,与药照组相比有差异显著性(P<0.05),而单照组、药照组与空白组相比,在不同时间点,P<0.01。MMP9的酶活性变化在单照组、药照组及空白组三组之间两两比较,差异均有显著性(P<0.05)。结论：1、照射可明显引起小型猪肺组织胶原含量的增加。2、小型猪放射性肺损伤形成过程中,肺组织中MMP2和MMP9的含量、蛋白表达及酶活性均显著增加,导致ECM的合成与降解失衡,促进放射性肺损伤的发展。3、肿节风可通过降低肺组织羟脯氨酸的含量,下调MMP2、MMP9的蛋白表达及酶活性,减缓放射性肺纤维化的进展,进而发挥放射防护作用。第三部分 放射性肺损伤的血清学标志及肿节风的防护作用目的：研究在放射性肺损伤发生发展过程中TGFβ1、SP-A、SP-D、MMP2和MMP9血清水平的变化,寻求可较好预测放射性肺损伤发生的血清标志物,并探讨肿节风对小型猪放射性肺损伤的放射防护作用。方法：应用ELISA检测小型猪的血清中TGFβ1、SP-A、SP-D、MMP2-和MMP9水平变化,明胶酶谱法检测血清MMP2和MMP9酶活性的变化。结果：1、血清TGFβ1、SP-A、SP-D、MMP2-和MMP9水平：照射后,药照组和单照组中小型猪的血清TGFβ1、SP-A、SP-D、水平均随照射后时间的延长逐步升高,但药照组中血清水平低于单照组的水平,且不同时间点,空白组、单照组与药照组三组之间两两比较,差异具有统计学意义(全部P<0.01)。单照组中血清MMP2水平在照射后第4周开始升高,但在第12周有所回落,第24周又开始升高,药照组中MMP2血清水平的变化趋势和单照组相似,但低于单照组,且其水平变化在空白组和药照组、单照组三组之间于不同时间点差异都有统计学意义(P<0.01)。照射后,单照组和药照组中血清MMP9水平呈现时间依赖性的升高,表现为单照组>药照组>空白组,且在不同的时间点,三组之间两两比较,差异具有显著性,只是在照射后12W,药照组与空白组、单照组相比,P<0.05,其余时间点两两相比,P<0.01。2、血清MMP2和MMP9酶活性：单照组和药照组中血清MMP2和MMP9酶活性均高于空白组,并随时间延长而增加,即：单照组>药照组>空白组。在照射后24W,单照组与药照组中血清MMP2和MMP9酶活性分别较空白组升高了约7.9倍和17.0倍,6.4倍和14.3倍。在不同的时间点,与药照组、空白组两两相比,差异具有显著性(MMP2：P<0.01; MMP9:除了照射后4W,单照组和药照组相比,P<0.05,其余时间点,两两相比,P<0.01。)结论：1、照射后TGFβ1、SP-A、SP-D、MMP2和MMP9的血清水平单独作为放射性肺损伤的血清学标志物均有一定的局限性,而联合检测可以互相弥补其不足,可早期诊断放射性性肺损伤,有助于早期进行防治。2、肿节风可通过降低促纤维化因子的血清学水平、保护肺泡Ⅱ型上皮细胞、下调血清MMP2、MMP9的水平及酶活性,来发挥对小型猪放射性肺损伤的防护作用。