【研究背景】本实验室前期研究发现,炎症因子TNF-α可促进胆囊癌的微淋巴管生成;且通过免疫组化检测分析发现VEGF-D(血管内皮生长因子-D)的表达与胆囊癌的淋巴管生成及淋巴结转移正相关。而VEGF-D是否与TNF-α介导的胆囊癌微淋巴管生成有关,尚未见研究报道。因此,本课题拟围绕两部分内容开展研究:1、TNF-α-VEGF-D轴对裸鼠胆囊癌原位移植瘤微淋巴管生成的影响;2、TNF-α促胆囊癌细胞VEGF-D表达的分子机制。旨在通过动物实验、启动子活性分析及信号通路研究等阐明TNF-α-VEGF-D轴与胆囊癌微淋巴管生成的关系及分子机制。【方法】1、用本实验室已构建的胆囊癌细胞株NOZ/sh VEGF-D(RNAi沉默VEGF-D)、NOZ/sh CTRL(转染阴性对照序列)及空白对照NOZ细胞,建立裸鼠胆囊癌原位移植瘤模型。建模后2周开始,实验组腹腔注射TNF-α(2μg/kg),对照组注射等体积生理盐水,每3天注射一次,连续注射3周后处死并解剖裸鼠,取原位癌组织及转移淋巴结标本制作石蜡切片,利用免疫组化及HE染色检测微淋巴管密度(LVD)及转移淋巴结,分析TNF-α-VEGF-D轴对裸鼠胆囊癌原位移植瘤微淋巴管生成的影响。2、通过DNA重组技术构建一系列含VEGF-D启动子截短片段的萤火虫荧光素酶报告质粒,用双荧光素酶检测系统分析VEGF-D启动子活性。3、应用软件TFbind、Promoter Scan对VEGF-D启动子上潜在的AP-1和/或NF-κB结合位点进行预测。4、通过碱基定点突变、电泳迁移率变动分析(EMSA)和染色质免疫沉淀(Ch IP)确定VEGF-D基因启动子上的AP-1和/或NF-κB结合位点及TNF-α对启动子活性的影响。5、应用RNAi沉默技术、蛋白特异阻断剂抑制实验检测TNF-α-VEGF-D轴上的信号通路分子。6、统计学分析方法:总体均数的比较采用t检验,显著性水平α=0.05,P<0.05为有统计学差异。【结果】1、TNF-α-VEGF-D轴对裸鼠胆囊癌微淋巴管生成及淋巴转移的影响:1)淋巴管密度计数结果显示,TNF-α干预NOZ组、NOZ/sh CTRL组、NOZ/sh VEGF-D组小鼠后,三组小鼠的淋巴管密度分别为23.73±2.17、23.20±2.18、10.07±1.83,与无TNF-α干预组比较(三组分别为11.73±2.28、14.27±1.36、5.67±1.25),差异均有显著性(P<0.05)。但TNF-α对NOZ/sh VEGF-D组的促淋巴管生成作用显著低于NOZ组和NOZ/sh CTRL组(P<0.05)。表明TNF-α可通过VEGF-D促进裸鼠胆囊癌原位移植瘤组织的微淋巴管生成。2)TNF-α干预NOZ组、NOZ/sh CTRL组、NOZ/sh VEGF-D组小鼠后,三组小鼠的淋巴结转移发生率均比无TNF-α干预组增高,但TNF-α对NOZ/sh VEGF-D组的淋巴结转移发生率低于NOZ组和NOZ/sh CTRL组,提示TNF-α可能通过VEGF-D促进裸鼠胆囊癌淋巴转移。2、TNF-α促胆囊癌细胞VEGF-D表达的分子机制1)成功构建一系列含VEGF-D启动子截短片段的重组质粒并经测序鉴定序列正确;双荧光素酶系统检测结果显示重组质粒PGL4-988较PGL4-717、PGL4-444较PGL4-325、PGL4-154较PGL4-57,均呈现出更强的荧光活性,差异有统计学意义(均P<0.05)。提示VEGF-D启动子转录起始位点ATG上游-988至-717nt、-444至-325nt、-154至-57nt三个区间可能存在调控VEGF-D转录活性的调控位点。2)TFbind、Promoter Scan软件预测结果显示,VEGF-D启动子转录起始位点ATG上游-444至-325nt区间存在两个潜在的AP-1结合位点:GTGTGTCAT(-401至-393nt)和CTGAGATAC(-345至-337nt),而-988至-717nt、-154至-57nt区间未检测到AP-1位点;三个区间均未检测到NF-κB结合位点。3)定点诱变、电泳迁移率变动分析(EMSA)和染色质免疫沉淀(Ch IP)实验证实转录因子AP-1可直接与VEGF-D启动子-444至-325nt区间的两个AP-1位点结合,且TNF-α可以增强AP-1与这两个位点的结合。4)AP-1位点突变对TNF-α诱导VEGF-D启动子活性的影响:“PGL4-AP1mut1+TNF-α”组较“PGL4-444+TNF-α”组(2.77±0.23 vs 3.98±0.15)、“PGL4-AP1 mut2+TNF-α”组较“PGL4-444+TNF-α”组(3.14±0.33 vs 3.98±0.15),荧光活性明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。表明TNF-α可通过两个AP-1结合位点调控VEGF-D的启动子活性。5)沉默AP-1对TNF-α诱导VEGF-D启动子活性及蛋白表达的影响:TNF-α诱导si AP-1 NOZ细胞的PGL4-444活性较NOZ细胞的弱(2.69±0.34 vs 5.88±0.15),差异有统计学意义(P<0.05);TNF-α诱导si AP-1 NOZ细胞的VEGF-D蛋白表达较NOZ细胞的弱(0.59±0.13 vs 1.39±0.10),差异有统计学意义(P<0.05)。表明TNF-α通过AP-1增强VEGF-D启动子活性并上调VEGF-D蛋白表达。6)MAPKs抑制剂对TNF-α诱导VEGF-D启动子活性的影响:“PD98059+TNF-α”组NOZ细胞的PGL4-444活性(1.74±0.23)较TNF-α组(5.88±0.15)明显减弱(P<0.05),“SP600125+TNF-α”组的PGL4-444活性(5.80±0.31)和“SB203580+TNF-α”组的PGL4-444活性(6.49±0.54)与TNF-α组比较差异均无显著性(P>0.05)。表明TNF-α通过ERK1/2通路增强VEGF-D启动子活性。7)MAPKs抑制剂对TNF-α诱导VEGF-D蛋白表达的影响:“PD98059+TNF-α”组NOZ细胞的VEGF-D蛋白表达(0.14±0.03)较TNF-α组(0.33±0.02)明显减少(P<0.05),“SP600125+TNF-α”组的VEGF-D蛋白表达(0.34±0.05)和“SB203580+TNF-α”组的VEGF-D蛋白表达(0.32±0.03)与TNF-α组比较差异均无显著性(P>0.05)。表明TNF-α通过ERK1/2通路上调VEGF-D蛋白表达。【结论】1、TNF-α可通过VEGF-D促进裸鼠胆囊癌原位移植瘤的微淋巴管生成。2、VEGF-D启动子-444至-325nt区间存在两个有活性的AP-1结合位点,且TNF-α可增强AP-1与这两个位点的结合;未检测到NF-κB结合位点。3、TNF-α通过“ERK1/2-AP-1”通路增强VEGF-D启动子活性并上调VEGF-D蛋白表达。