三草颗粒对Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的作用及机制研究

来源 :成都中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shinboy_zsl
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背景:三草颗粒源于原解放军三O二医院著名肝病专家汪承柏教授治疗自身免疫性肝病协定处方“愈肝方”,由茜草、豨莶草、秦艽、丹参、连翘、甘草六味中药组成。课题组前期研究表明,三草颗粒可阻断免疫介导的肝损伤向肝纤维化、肝硬化发展。然而,其对小鼠急性免疫性肝损伤的作用及机制尚不明确。目的与意义:本研究围绕“源于临床,证于实验,回归临床”的研究思路,以三草颗粒为研究对象,以刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)诱导的小鼠急性免疫性肝损伤为研究载体,旨在探索三草颗粒对Con A介导的急性免疫性肝损伤的作用及机制,为临床三草颗粒治疗自身免疫性肝炎提供理论依据。方法:本研究以Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤为载体,采用传统药理学、分子生物学手段,并结合代谢组学,系统考察三草颗粒对Con A介导的小鼠急性免疫性肝损伤的作用及机制。结果:本研究结果显示,与空白组相比,模型组小鼠血清肝功能指标ALT、AST水平显著升高,肝组织中可见肝血窦充血,汇管区中性粒细胞浸润,细胞质空泡化,肝细胞大量凋亡,表明模型复制成功;同时,模型组小鼠可见血清中Th1型细胞因子表达显著升高。与模型组相比,三草颗粒可不同程度改善Con A诱导的小鼠急性肝损伤,表现为血清肝功能指标ALT、AST的显著降低、肝组织病理损伤的显著缓解、肝组织中性粒细胞浸润、肝细胞凋亡及Th1型细胞因子分泌的显著减少,表明三草颗粒对Con A介导的小鼠急性肝损伤具有良好的保护作用。与模型组相比,给予小鼠NKT细胞抑制剂——PK136预处理,可见小鼠血清肝功能水平ALT、AST升高水平被显著抑制,肝组织病理损伤程度被显著改善,表明Con A诱导的小鼠急性肝损伤为NKT细胞依赖性。与PK136组比较,三草颗粒对小鼠血清肝功能水平与肝组织病理损伤无显著影响,表明三草颗粒对Con A所致小鼠急性肝损伤的保护作用为NKT细胞依赖性。采用分子生物学手段,考察三草颗粒改善小鼠急性免疫性肝损伤的作用机制。结果显示,与空白组相比,模型组肝组织中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)、FAS配体(FAS ligand,FASL)与受体DR5、FAS表达及其下游信号分子IL-33、Caspase-3表达水平显著升高,表明Con A所致小鼠肝损伤与TRAIL、FASL介导的细胞凋亡相关。与模型组相比,PK136组小鼠肝细胞表面受体DR5、FAS及下游蛋白IL-33的表达水平显著降低;三草颗粒组TRAIL、FASL介导的细胞凋亡通路相关蛋白TRAIL、FASL、DR5、FAS、IL-33、Caspase-3表达水平显著降低,但与PK136组无显著差别,表明三草颗粒对TRAIL、FASL介导的细胞凋亡通路的作用为NKT细胞依赖性,与药效学结果一致。通过代谢组学研究共筛选出9个与三草颗粒治疗急性免疫性肝损伤密切相关的代谢生物标志物,包括PC、Palmitic acid、O-Phosphoethanolamine、PGF2、Eleic acid、Linoleic acid、LysoPA、15(S)-HETE、Cytidine monophophate。通过对筛选出的9个代谢标志物相关的代谢通路进行富集与分析,得到8条可能参与三草颗粒对Con A所致小鼠急性免疫性肝损伤调节作用的代谢通路,包括脂肪酸合成、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、鞘脂代谢、线粒体脂肪酸延长、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、嘧啶代谢。通过建立“代谢标志物-靶点-成分”交互网络,对代谢标志物、疾病靶点及三草颗粒活性成分间的关系进行可视化反映。分析发现,13种三草颗粒化学成分直接作用于9个药物靶点,并与3种代谢标志物直接作用。其中药物靶点ALOX5、CYP4501A2、CYP4503A4、FAS、CYP4501B1在此网络中具有重要的作用。对上述靶点进行测定,结果显示,三草颗粒可显著降低Con A诱导的小鼠肝组织中ALOX5,CYP450 1A2,CYP450 3A4,CYP4501B1的高水平表达,同时,可升高FAS的低水平表达。结论:本研究证明了三草颗粒对Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用,并结合分子生物学、代谢组学、网络药理学等手段,系统解析了三草颗粒保肝作用机制为NKT细胞依赖性TRAIL、FASL介导的细胞凋亡通路。本研究为三草颗粒的进一步开发为自身免疫性肝炎治疗药物提供了理论依据。
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