第一部分顺磁性蛋白修饰的非靶向双模态探针的制备与表征目的：合成一种新型非靶向MR—荧光双模态探针CuInS2/ZnS@BSA-DTPAGd,并对其理化性质进行表征。材料与方法：1. 近红外量子点CuInS2/ZnS的制备：1)称取Cu(acac)2 (26.2 mg), In(acac)3 (41.2mg)装入三口圆底烧瓶(25 mL)中,并向其中加入过量的DDT溶液(兰15 mL),将装置密封并在室温下通入惰性气体(Ar)以排空装置内的空气,升温至230℃并剧烈搅拌2 h,生成CuInS2前体。2)称取Zn(OAc)2 (70 mg)溶解于ODE (4 mL)、 OA (1 mL)和OLA (1 mL)的混合溶液中,在无氧条件下将制备的CuInS2前体重新加热至220℃,然后每隔20分钟向CuInS2中加入提前制备的ZnS溶液,最后得到的产物冷却至室温后进行离心纯化至少三次(10000 r/min,15 min),得到的沉淀分散于氯仿中。2. BSA-DTPAGd的制备：1)称取BSA粉末(1 g)溶解于15 mL硼酸盐溶液中(50 mmol/L, pH=8.2)。称取DTPAA (1g)溶解于5 mLDMSO溶液,充分搅拌混匀后逐滴加入配置好的BSA溶液中,控制pH范围约8.0-8.5,室温下反应4 h,得到BSA-DTPA溶液。用柠檬酸二钠溶液(0.1mol/L, pH=6.5)透析除去多余的DTPAA和DMSO,纯化备用。2)将GdCl3 (0.5 g)溶解于5 mL醋酸钠溶液(0.1 mol/L, pH = 6.5),得到的GdCl3溶液逐滴加入BSA-DTPA溶液中,室温下反应24 h,用柠檬酸二钠溶液(0.1 mol/L, pH=6.5)透析纯化,得到的产物冻干成粉末状BSA-DTPAGd,4℃下保存备用。3. 顺磁性量子点CuInS2/ZnS@B S A-DTPAGd(pQDs)的合成与纯化：称取BSA-DTPAGd粉末(0.5 g)溶于30mL去离子水,溶液盛于烧杯中。将烧杯置于超声细胞粉碎仪下,并保证探针浸入液面下至少5mm,设置超声粉碎仪参数：超声时间=10 s,间隔时间=10 s,总时间=20 min,功率=200 W。在超声过程中逐滴加入制备好的CuInS2/ZnS溶液,反应后的白色悬浊液通过旋转蒸发器除去多余的油溶液,得到的澄清溶液进行超速离心纯化(70,000 g/min,15 min)至少2次,产物分散在硼酸溶液中(50 mmol/L, pH=8.2)保存备用。4. pQDs的表征：通过粒径分析仪测量量子点的水合粒径；透射电镜(TEM)观察量子点的形貌；荧光分光光度计对比顺磁性蛋白包裹前后量子点的光学性能,激发波长为470 nm；1.41 T核磁共振谱仪评估pQDs的弛豫性能；0.5 T磁共振成像仪行探针的体外MR成像。结果：粒径分析仪及透射电镜结果显示pQDS粒径约为45 nm,形态为分布均匀的球形颗粒；荧光分光光度计测得pQDs波长约630 nm,达到近红外量子点标准,具有良好的光学性能,紫外灯下观察探针呈明亮的红色荧光；体外弛豫性能测得pQDs的r1、r2值分别为15.233mM-1s-1、26.058 mM-1s-1, r2/r1值为1.71,为顺磁性纳米颗粒,可用于T1成像；体外MR成像显示随着钆离子浓度的增加,pQDs的T1加权信号强度逐渐增强。结论：所制备的非靶向探针CuInS2/ZnS@BSA-DTPAGd不仅具有较好的近红外量子点的光学特性,而且又具有良好的弛豫性能,为成功构建针对CD133+-胶质瘤干细胞的靶向双模态探针奠定了基础。第二部分顺磁性蛋白修饰的靶向双模态探针的制备以及针对CD1 33+胶质瘤干细胞的体内外双模态成像研究目的： 制备顺磁性蛋白修饰的靶向双模态探针CuInS2/ZnS@BSA-DTPAGd-CD133mAb(pQDs-CD133mAb)并检测其在体内外对SU2s干细胞的靶向成像能力。材料与方法：1. 干细胞SU2s的培养及胶质瘤动物模型建立：将SU2s干细胞株接种于无血清的DMEM/F12培养基中,并加入神经干细胞所需生长因子,置于37℃,5% CO2的培养箱中孵育,并在倒置显微镜下观察细胞的生长情况。裸鼠皮下接种GSCs,约3周后成瘤明显。2. 细胞毒性实验：通过改良MTT法评价pQDs探针对SU2s干细胞活性的影响。收集对数期SU2s干细胞接种于96孔板,反复吹打至细胞悬液,在37℃,5%CO2下孵育24 h后,用PBS洗净并按照Cu2+-浓度梯度加入等量不同浓度的pQDs,每组包括3复孔,并设置调零孔(仅加入等量的单纯干细胞培养基),37℃,5% C02下分别培养24 h和48h。避光向每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)继续培养4h后,低速离心并小心除去上清,得到的沉淀分散在100μL DMSO中。酶联免疫检测仪检测各孔A570的吸光度以评估细胞活性。3. pQDs-CD133mAb靶向性双模态探针的合成与纯化：按照1：10：4000的摩尔比将pQDs、CD133mAb和EDC·HCl偶联剂混合,室温下反应2h。得到的反应产物进行超速离心纯化(100,000 g/min,30min)至少2次,沉淀分散在PBS中(0.01 mol/L, pH=7.4,0.5% BSA,0.02%叠氮化钠)。4. pQDs-CD133mAb探针对SU2s干细胞的靶向荧光成像实验：取对数期生长的SU2s干细胞,反复吹打至细胞悬液,取20 μL细胞悬液滴于洁净载玻片上,并分别与等Cu2+浓度的pQDs-CD133mAb、pQDs共同孵育5、10、20、30min后在荧光显微镜下观察探针的体外靶向荧光成像效果。5. 探针对SU2s干细胞的靶向MR成像研究：取对数期生长的SU2s干细胞反复吹打至细胞悬液(1×106/m1)并接种于6孔板(1 mL/孔),分别与相同钆离子浓度的pQDs-CD133mAb、pQDs、马根维显共同孵育30min,同时设置以生理盐水孵育的细胞为对照组,将细胞充分洗净后转移至96孔板(20此),通过3.0T磁共振仪扫描获得T1加权成像,评价探针的体外靶向MR成像效果,具体参数如下：TR= 2000ms, TE= 108 ms,矩阵=256×192, FOV= 80 mm×80 mm,层厚=2.0 mm。6. 探针在动物体内的生物代谢分布及毒理研究：将pQDs探针经尾静脉注射入健康成年裸鼠体内,分别于6h、24h、48 h、4d及7d后处死并取其主要脏器,包括心、肝、脾、肺、肾及大肠,通过等离子体质谱(ICS-MS)测定各脏器内Cu2+-浓度,评估探针在体内的主要代谢途径；另取部分脏器组织制成H&E染色切片,评估探针在体内的毒理改变。7. 探针在荷瘤裸鼠体内的靶向双模态成像：将等量等Cu2+-浓度的pQDs-CD133mAb与pQDs经尾静脉注射入皮下荷有CD133+-胶质瘤的成年裸鼠体内,通过活体荧光成像仪行在体胶质瘤的荧光成像,评价探针在体内的靶向荧光效果；另经尾静脉向荷瘤裸鼠体内注射等量等钆离子浓度的pQDs-CD133mAb与pQDs,同时设置等钆离子的马根维显作为对照组,将裸鼠置于3.0T磁共振扫描仪下行T1加权成像,以评估探针在体内的靶向MR成像效果,具体参数如下：TR= 200 ms, TE= 18.2 ms,矩阵=256×192, FOV= 80 mm×80 mm,层厚=2.0 mm。结果：细胞毒性实验显示,随着浓度的减低,探针对SU2s干细胞的毒性逐渐降低,且细胞活性基本维持在80%以上。荧光显微镜下观测到,随着时间延长,pQDs-CD133mAb逐渐在SU2s干细胞表面特异性聚集,荧光强度明显增加,而pQDs仅有少量非特异性吸附。活体荧光成像显示,注射有靶向性探针的裸鼠,其肿瘤的荧光信号强于非靶向组。体内外T1加权磁共振成像显示,靶向组信号强度明显强于非靶向组,并且明显强于等钆离子浓度的马根维显(Gd-DTPA)组。生物代谢分布及毒理实验说明探针并未对小鼠各脏器组织造成明显的毒性,安全性良好。结论：所构建的双模态探针CuInS2/ZnS@BSA-DTPAGd-CD133mAb探针可在体外靶向识别SU2s干细胞并能实现MR荧光双模态成像,并且在荷瘤裸鼠体内也展现了较好的靶向特异性。