缝隙连接在HCY和TGF-β1介导大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用及机制研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lwsea
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目的:探讨缝隙连接在同型半胱氨酸(Hcy)和转化生长因子β1(TGF-β1)介导大鼠血管平滑肌细胞增殖中作用及机制。方法:(1)用组织贴块法原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),用胰蛋白酶消化法进行细胞传代培养,α-平滑肌肌动蛋白(α-Actin)相关抗原鉴定。取3-5代细胞,MTT法检测不同浓度Hcy(0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5mmol/L)和不同浓度TGF-β1(0、0.01、0.1、1、10ng/mL),作用不同时间(0、12、24、48、72h)对VSMC增殖的影响,确定Hcy和TGF-β1作用浓度和作用时间,然后分8组:Control组、Hcy组、TGF-β1组、Hcy+TGF-β1组、缝隙连接阻断剂(18α-GA)组、Hcy+18α-GA组、TGF-β1+18α-GA组和Hcy+TGF-β1+18α-GA组;(2) MTT法及流式细胞仪检测大鼠VSMC增殖活性;(3)免疫荧光技术观察大鼠VSMC中Cx43、Cx40蛋白表达及定位;(4)Western blotting技术检测大鼠VSMC中Cx43、Cx40蛋白表达;(5)染料示踪分子传递法(划痕标记染料传输法)检测大鼠VSMC缝隙连接功能。(6)实验数据用均数±标准差表示,组间比较用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK法检验。所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:(1)大鼠VSMC中Cx43与Cx40蛋白表达呈阳性,两者共定位于胞浆。(2) MTT法检测不同浓度Hcy、TGF-β1,不同作用时间对大鼠VSMC增殖影响的结果发现:Hcy对大鼠VSMC的增殖呈现时间依赖性,随时间延长VSMC增殖增加。不同浓度Hcy对VSMC增殖的影响呈现出复杂的效应。与Control组相比,低浓度时(0.01mmol/L)抑制增殖,至0.025mmol/L时,促进增殖;0.05mmol/L时,增殖减缓;至高浓度(0.1mmol/L),增殖最大;浓度进一步升高至0.2mmol/L、0.5mmol/L时,增殖趋势变缓。Hcy浓度0.1mmol/L在24h时,与其他各浓度均有统计学差异,增殖最显著。TGF-β1对大鼠VSMC增殖的影响呈现时间依赖性和浓度依赖性。随时间延长VSMC增殖增加。浓度为0.01ng/mL和0.1ng/mL时,与control组相比无统计学差异;至1ng/mL、10ng/mL时,增殖显著,且10ng/mL和1ng/mL相比,在24h和48h时增殖更显著。(3) MTT法检测不同处理因素对大鼠VSMC增殖影响的结果发现:与Control组相比,Hcy组、TGF-β1组VSMC A570值增加显著(P<0.05),18α-GA组VSMC A570值减少(P<0.05);与Hcy组相比,Hcy+18α-GA组VSMC A570值减少(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+18α-GA组VSMC A570值减少(P<0.05);与Hcy组、TGF-β1组相比,Hcy+TGF-β1组VSMC A570值减少(P<0.05)。(4)细胞周期检测:与Control组相比,Hcy组VSMCS值增加显著(P<0.05),TGF-β1组VSMC S值有增加趋势,但无统计学差异。18α-GA组VSMC S值减少(P<0.05);与Hcy组相比,Hcy+18α-GA组VSMC S值降低(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+18α-GA组VSMC S值降低(P<0.05);与Hcy组、TGF-β1组相比,Hcy+TGF-β1组VSMC S值降低(P<0.05)。(5)Western blotting检测发现:①各组间Cx40表达的变化:与Control组相比,Hcy组、TGF-β1组表达增强(P<0.05),18α-GA组无显著差异(P>0.05);与Hcy组相比,Hcy+18α-GA组表达减弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1组表达减弱(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+18α-GA组表达减弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1组表达减弱(P<0.05)。与Hcy+TGF-β1组相比,Hcy+TGF-β1+18α-GA组表达减弱(P<0.05)。②各组间Cx43表达的变化:与Control组相比,Hcy组、TGF-β1组表达增强(P<0.05),18α-GA组无显著差异(P>0.05);与Hcy组相比,Hcy+18α-GA组表达减弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1组表达减弱(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+18α-GA组表达减弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1组表达减弱(P<0.05)。与Hcy+TGF-β1组相比,Hcy+TGF-β1+18α-GA组表达无显著差异(P>0.05)。③各组间磷酸化Cx43(P-Cx43)与非磷酸化Cx43(NP-Cx43)比值变化:与Control组相比,Hcy组表达无显著差异(P>0.05),TGF-β1组表达减弱(P<0.05),18α-GA组显著减弱(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+18α-GA组表达减弱(P<0.05)。(6)划痕标记染料传输法检测发现:与Control组相比,Hcy组明显增强(P<0.05),TGF-β1、Hcy+TGF-β1组差异无统计学意义(P>0.05),18α-GA组显著减弱(P<0.05);与Hcy组相比,Hcy+18α-GA组减弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1组减弱(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+18α-GA组减弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1组无显著差异(P>0.05)。与Hcy+TGF-β1组相比,Hcy+TGF-β1+18α-GA组减弱(P<0.05)。结论:(1) TGF-β1主要通过上调大鼠血管平滑肌细胞Cx40、Cx43蛋白表达及抑制Cx43蛋白磷酸化,从而促进了大鼠血管平滑肌细胞的增殖;(2) Hcy主要通过上调大鼠血管平滑肌细胞Cx40、Cx43的蛋白表达,引起缝隙连接通讯功能的增强,促进了大鼠血管平滑肌细胞的增殖;(3) TGF-β1和Hcy联合作用可能通过下调大鼠血管平滑肌细胞Cx40、Cx43蛋白表达,对大鼠血管平滑肌细胞增殖具有负协同作用。
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