论文部分内容阅读
由于近些年化石能源的大幅度减少，燃料酒精作为可再生的绿色环保液体燃料，早已成为世界各国的关注焦点与研究热点。酒精的工业生产主要利用酒精酵母的厌氧发酵进行，其中甘油是主要的副产物。如果被甘油消耗的那部分碳源能用来生产酒精，就可以提高酒精的产率和原料的利用率。本文以此为出发点，对工业酒精酵母进行改造，试图构建能不影响生长速率而又有效降低甘油生成、提高酒精得率的新型工业菌株。已有研究表明直接阻断甘油的合成途径会影响工业酒精酵母的生长与发酵性能，因此需要寻求更佳的改造策略。在酒精酵母细胞中存在着两条分解甘油的途径：甘油-3-磷酸途径和二羟基丙酮途径，其中甘油-3-磷酸途径在有氧条件下起作用。而二羟基丙酮途径在厌氧条件下起作用，该途径包含GCY1或YPR1基因编码的甘油脱氢酶和由DAK1或DAK2基因编码的二羟丙酮激酶。在工业酒精酵母中，以rDNA为整合位点，加强表达酒精酵母自身的编码甘油脱氢酶的GCY1基因和编码二羟基丙酮激酶的DAK1基因，得到转化子S.cerevisiae GDS1(PPGK-GCY1-DAK1-kan)。在葡萄糖浓度为15%的基础发酵培养基中，比较重组菌GDS1与出发株工业酒精酵母发酵性能的差异。重组菌GDS1的酒精产量为73.4g/L，酒精得率提高了2.9%，甘油产率降低了24.9%。另外重组菌GDS1胞内NADH的浓度为0.0273mmol/g-DCW高于亲本酒精酵母的0.0152mmol/g-DCW。为了调节细胞内辅酶NADH的含量，有效发挥引入甘油分解途径的效果，探讨了在工业酒精酵母细胞中表达与NADH代谢有关的四种基因，来优化重组菌细胞内氧化还原平衡。这四种基因分别是来源于蜡状芽孢杆菌的编码非磷酸化的、NADP+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因gapN，来源于大肠杆菌的编码NAD+依赖型乙醛脱氢酶的基因mhpF，来源于大肠杆菌的编码NAD+依赖型的富马酸还原酶的基因frdA和来源于酒精酵母的编码NADH激酶的基因POS5。分别构建游离表达载体pYX212-gapN-kan，pYX212-POS5-kan，pYX212-mhpF-kan和pYX212-frdA-kan，然后成功转入工业酒精酵母中，得到重组菌GAS1、POS1、MHS1和FRS1。比较重组菌与出发菌的发酵性能，表达gapN、POS5、mhpF基因都能通过降低辅酶NADH含量来减少甘油的生成，其中表达了mhpF基因的重组菌MHS1在0小时添加2g/L的乙酸时，酒精产量为74.3g/L，较原始菌提高了4.6%，甘油产量降低了40%。进一步通过Cre/loxp重组酶系统敲除重组菌S.cerevisiae GDS1(PPGK-GCY1-DAK1-kan)中的抗性基因kan，在重组菌S.cerevisiae GDS1中表达mhpF基因，得到重组菌S.cerevisiae GDMS1。通过发酵实验得到重组菌GDMS1酒精产量为74.9g/L，较原始菌提高了5.5%，甘油产量为3.56g/L，较原始菌降低了48%。重组菌GDMS1细胞内的辅酶NADH浓度为0.0178mmol/g-DCW，比重组菌GDS1的0.0273mmol/g-DCW低，但又比出发株工业酒精酵母的0.0152mmol/g-DCW要高。