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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的肠道传染病。2010年以来,该病在我国多个省份暴发流行,给生猪产业造成了巨大的经济损失。当前,该病已成为制约我国养猪业健康发展的重要猪病之一。河南省是我国养猪大省,2010年以来的PED疫情给该省的养猪业带来了沉重打击和持续性影响。针对本次疫情开展PEDV的遗传进化分析及免疫学检测方法研究,对于认识该病的流行规律、建立针对性的防控措施至关重要。PEDV的S蛋白是位于病毒粒子表面的结构蛋白,含有PEDV的主要抗原表位,是建立PEDV诊断方法的重要靶抗原,S基因也是PEDV分子流行病学研究的主要候选基因;ORF3是PEDV唯一的一个辅助蛋白,与病毒的毒力有关,可以用于区分PEDV的强、弱毒株。本论文开展了基于ORF3基因和S基因的PEDV遗传进化分析,对于明确河南省PEDV的流行规律及分子遗传特征具有重要意义;N蛋白是PEDV的衣壳蛋白,也是PEDV的主要结构蛋白之一。在PEDV感染早期,猪体内就能检测出高水平的抗N蛋白抗体。因此,N蛋白可以作为靶蛋白用于PEDV的早期诊断;另外,PEDV作为猪的一种肠道病毒,引起的免疫应答主要以粘膜免疫为主,IgA抗体水平更能反映病毒感染情况及疫苗免疫保护效力,建立PEDV IgA抗体检测方法对于PEDV的疫苗免疫评价意义重大。本论文通过制备PEDV的S和N重组蛋白,分别建立了基于重组S蛋白的PEDV IgA抗体检测方法和基于重组N蛋白的PEDV IgG抗体免疫层析快速检测试纸。研究内容和结果如下:1.采用RT-PCR方法,对来自河南省许昌、新郑、平顶山、郑州、新乡、鹤壁、开封、驻马店、周口、洛阳、三门峡等地的116个不同规模大小的猪场开展了PEDV病原学检测。结果显示,发病猪群粪便和乳汁中PEDV的阳性率分别为60.8﹪和56.7﹪;以PEDV的ORF3基因和部分S基因为靶基因,对14个PEDV阳性样品毒株进行克隆、测序并进行了遗传进化分析。结果表明,14个PEDV毒株之间ORF3基因核苷酸序列的相似性为96.7-100.0﹪之间,氨基酸序列的相似性为94.0-100.0﹪,与参考毒株之间核苷酸序列的相似性为96.9-99.8﹪,氨基酸序列的相似性为94.5-99.3﹪;基于ORF3和部分S基因的核苷酸序列构建的进化树显示,14个样品毒株之间以及与国内毒株CH/ZMDZY/11、BJ-2011-1、JS-HZ2012、GD-B、CH/FJZZ-9/2012、CH/FJND-3/2011和CH/S亲缘关系较近,而与SM98、LZC及CV777遗传距离较远;根据S基因推导的氨基酸序列分析结果显示,14个样品毒株在抗原表位区7-146 aa和271-278 aa存在较为集中的氨基酸变化,推测这些氨基酸的变化可能改变了PEDV流行毒株的抗原性,从而影响了疫苗的免疫效果。2.采用HE染色、免疫组化及形态学方法,研究了毒株CH/HNQX-3/14引起仔猪肠道的病理学变化,初步证实了回肠绒毛M细胞在PEDV感染中的重要性;在全基因组测序的基础上,开展了病毒基因组的序列比较、系统发育和重组分析。结果显示,与CV777株相比,CH/HNQX-3/14的S基因存在4个明显的缺失区域(nt 20,813-20,824,nt 21,058-21,063,nt 21,127-21,132和nt 22,252-22,257)。其基因组序列与CH/ZMDZY/11相似性最高(99.1﹪);重组分析发现CH/HNQX-3/14基因组当中存在4个可靠性较高的潜在重组断点,分别位于ORF1a(nt 2,769)、S(nt 20,691和nt 22,176)和N(nt 27,252)基因中。CH/HNQX-3/14的核苷酸序列在断点(nt 2,769)前和断点(nt 27,252)后区域主要来自于CV777,在断点nt 20,691和nt 22,176之间区域主要来自于DR13(韩国疫苗株的亲本毒株)。推测CH/HNQX-3/14为嵌合式毒株,可能由CV777、DR13和CH/ZMDZY/11 3个毒株通过基因重组演化而来。3.对PEDV流行毒株(CH/HNQX-3/14)的部分S1基因(包含499-638 aa,748-755aa和756-771 aa 3个抗原表位区)进行了克隆,并构建了重组表达质粒pET30a(+)-pS1,转化大肠杆菌BL21后,通过优化表达条件,获得了可溶性表达的重组pS1蛋白,该蛋白能够与猪的PEDV阳性血清发生特异性反应。以纯化后的重组pS1蛋白作为包被抗原,初步建立了PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法,该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,与韩国BIONOTE公司生产的PEDV IgA抗体检测试剂盒相比,检测血清和乳汁的符合率分别为93.6﹪和93.9﹪,可应用于PEDV IgA抗体的临床检测及免疫评价。4.构建了用于表达PEDV N蛋白的pET28a(+)-N重组质粒,转化大肠杆菌BL21后,通过优化表达条件,实现了其可溶性表达。经Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析对重组N蛋白进行纯化后,以胶体金标记N蛋白固定在结合垫上作为检测探针,分别用1.0mg/mL的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)和2.9 mg/mL的His单抗包被硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,制备组装成免疫层析检测试纸,该试纸与TGEV、CSFV、PRRSV、PRV及FMDV的阳性血清无交叉反应,与商品化进口ELISA试剂盒的符合率为94.0﹪。该试纸的研制为PEDV的早期快速诊断提供了新的技术手段。