论文部分内容阅读
原核生物对于外胞质逆境环境的胁迫应答通常由外胞质功能因子ECF进行调控，ECF是数量最大、种类最多的一类σ因子，归属于σ70家族3。该家族σ因子在保护细菌免受外界逆境环境冲击、调控致病菌分泌蛋白形成以及维持致病菌在巨噬细胞中的存活上发挥重要作用。耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）具有逆境环境胁迫的超强适应性。该菌中仅含有3个σ因子：SigA（DR0916）、Sig1（DR0180）和Sig2（DR0804），其中Sig1是一个预测的ECF σ因子。作为基因转录的重要元件之一，其生理功能未知。本研究通过构建耐辐射异常球菌sig1基因缺失突变株和功能回补菌株，利用逆境胁迫冲击实验、荧光实时定量技术以及β-半乳糖苷酶活性分析，对该基因功能进行了深入研究，得到了以下研究结果：Sig1由位于I号染色体上的基因DR0180编码，长度为690bp，编码229个氨基酸，蛋白分子量为25.89kDa。KEGG数据库显示Sig1属于ECF亚家族。氨基酸序列比对显示，Sig1蛋白与同属中的σ因子相似性高，序列一致性为77.15%，且ECF结构域在Deinococcus属中高度保守。另外，Sig1与结核分枝杆菌中的SigE相似性最高，为37%，二者的三级结构比对同样证实了这一点。利用融合PCR技术构建了sig1缺失突变株（Δsig1）和功能回补株。在正常条件下sig1基因的突变不影响该菌的生长。荧光实时定量PCR结果显示，该基因在菌株的对数生长初期和中期表达量较高。在热激（48℃）、100mM过氧化氢冲击、15%乙醇冲击以及酸冲击（pH4）下，突变株生长状况和野生型相比均发生显著下降。Biolog实验分析显示，sig1基因突变显著影响了菌株对α-D葡萄糖、D-核糖等10种碳源的利用能力。野生型菌株的sig1基因48℃热激后，在6小时内均上调表达，且在热激1h时表达量最高。sig1基因突变导致热激相关分子伴侣和抗性基因（dnaJ1、groEL、DR0972等）显著下调，表明sig1基因能在高温环境中起到调控作用。除此以外，还发现sig1基因参与了氧化胁迫的应答调控。在100mM过氧化氢冲击下，sig1突变导致了氧化抗性相关基因（katE、sodC、pod、cat3）的下调。为了进一步探究sig1基因的热激胁迫调控机制，我们利用β-半乳糖苷酶活性实验，分别分析了部分热激相关基因（DR1314、DR0972、dnaJ1、pspA）的启动子活性。结果显示，热激（48℃）1h后，Δsig1突变株中DR0972、dnaJ1、pspA的β-半乳糖苷酶活性较野生型相比有所下降，推测sig1基因可能参与了上述热激胁迫相关基因的转录。本研究基本鉴定了耐辐射异常球菌中外胞质功能σ因子Sig1在逆境胁迫条件下的功能，探索了该基因在热激和氧化胁迫中的调控作用。本研究还成功构建了Sig1蛋白表达菌株并得到了纯化蛋白，这为今后进行体外DNA结合试验、蛋白晶体结构研究奠定了基础。关于Sig1在逆境抗性调控网络中的作用机制目前尚不清楚，仍需进一步研究。