亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction chromatography, HILIC)是一种使用极性固定相来有效分离极性化合物的非常合适的手段,在一定程度上克服了反相色谱(Reversed phase chromatography, RPLC)无法保留强极性化合物和正相色谱(Normal phase chromatography, NPLC)难以为强极性化合物提供足够的溶解性等缺点,可用于极性分子、多肽和蛋白质等的分离。但是对于溶质在HILIC的保留机理却一直存在争议,包括经典的吸附和分配机理在内的多种保留模型也各有其优势和不足,而且对于蛋白质在HILIC模式下的保留机理研究尚无人问津。液相色谱的计量置换保留理论(Stoichiometric displacement theory for retention, SDT-R)是依据溶质、溶剂和固定相间的5个热力学平衡推导出的描述溶质在色谱过程中保留行为的理论模型,是小分子溶质公认的4个定量模型之一,同时也是生物大分子唯一的一个公认的保留机理,而且已得到除排阻色谱(Size exclusion chromatography)以外的多种色谱模式的验证,其优势和特点表明了SDT-R在HILIC模式中的应用潜力。本论文将计量置换理论应用于HILIC模式溶质保留机理的研究中,推导出了典型HILIC流动相范围内以及全浓度范围内适用于HILIC模式溶质保留的数学表达式,并通过小分子和蛋白质两类溶质在不同的HILIC色谱柱的保留值进行验证,从理论上描述了流动相-溶质-固定相三者的关系,同时利用溶质在吸附和解吸附过程中热力学函数的变化,从热力学角度进一步阐明溶质在HILIC的保留机理,这表明了计量置换理论在HILIC模式下溶质保留机理研究中的优势和合理性,对HILIC的发展有重要的指导作用。全文主要包括以下五部分：1.文献综述：系统评述了HILIC分离模式的特点和应用,重点评述了HILIC中溶质保留机理的研究现状和计量置换理论(Stoichiometric displacement theory, SDT)的原理及应用,并分析了SDT应用于HILIC的研究意义。2.SDT对小分子溶质在HILIC中保留机理的研究：依据SDT,考虑到溶质、溶剂-固定相三者之间的相互作用和5种热力学平衡,从理论上推导出了在HILIC上溶质的计量置换保留模型的数学表达式,表明水为置换剂,在一定条件下,溶质的lgk’与流动相中lg[H2O]成线性关系,并给出了各参数的物理意义。其斜率Z为溶剂化溶质被溶剂化固定相吸附时从二者接触面上释放出的置换剂水分子的摩尔数,截距lgI为溶质对固定相亲和势。并通过30℃下15种溶质在不同类型HILIC固定相上的保留进行了验证,结果表明15种溶质在不同类型的HILIC色谱柱上的lgk’对lg[H2O]作图均呈现良好的线性,表明了SDT-R应用于HILIC的合理性；通过与吸附机理和分配机理的比较,从准确性、参数的物理意义和对溶质-流动相-固定相三者在色谱过程中相互之间定量关系的解释等方面均表现出SDT-R的合理性和优势；由不同类型HILIC固定相上15种溶质的lgI对Z作图,得到了分别描述置换剂对固定相亲和势和柱相比的参数j和lgφ,j的平均值为1.70,十分接近水的理论j值,从理论上证明了水为HILIC中的强置换剂；同时模拟了溶质在保留时与亲水固定相相互作用时的分子取向,结果表明非极性的色散力仍然是不可忽略的作用力,并对溶质在HILIC模式下的保留过程进行了详细的探讨,从理论假设和实验事实的角度给出了存在极性相互作用力的HILIC模式下lgI对Z作图仍然呈线性的原因。3.SDT对蛋白质在HILIC中保留机理的研究：通过对标准蛋白在HILIC色谱柱上的保留研究,发现在添加了甲酸和甲酸铵的流动相中蛋白质的出峰顺序基本相同；通过4种固定相上蛋白质lgk’与lg[H2O]呈现良好的线性,得到的蛋白质的lgI和Z值也比小分子溶质大得多；6种蛋白的lgI对Z值作图也获得了良好的线性,说明蛋白质在HILIC下的保留遵循SDT,但拟合出的斜率值j却明显小于水的理论j值；在流动相中添加甲酸和甲酸铵体系对胰岛素保留值的影响的研究证明甲酸的确参与了置换过程,而且甲酸含量的增加也会影响j和lgφ值,证明了甲酸的存在即是水的j值减小的主要原因；流动相中甲酸浓度对小分子溶质保留的影响的初步研究发现固定水含量不变时,溶质的lgk与lg[FA]呈现良好的线性关系,这表明甲酸在小分子溶质的HILIC保留过程中也起到了置换剂的作用。4.统一的SDT在HILIC中的应用-双保留机理：使用合成的β-CD柱来研究极性不同的小分子溶质的亲水-反相双保留模式规律,通过三类极性不同小分子溶质在全浓度范围内保留值的测定,发现其保留行为随着水浓度变化均呈现U型的趋势,最低点左半支和右半支分别对应于亲水保留模式和反相保留模式,证明流动相组成变化是将溶质保留模式在亲水和反相之间转变的重要因素；HILIC和RPLC模式下溶质自身疏水分配常数lgP对溶质保留的影响研究表明,在RPLC下溶质保留由强到弱的顺序与lgP值由大到小的顺序一致,但在HILIC模式下却并非完全一致；依据SDT,从热力学平衡的角度推导出了溶质在RPLC/HILIC双保留色谱柱上的“U”型洗脱曲线的数学模型公式,并通过多种溶质的保留值进行拟合和对比,结果表明三类溶质的拟合曲线的符合程度都很高,同时给出了RPLC/HILIC双保留过程的具体解释,也体现了统一的SDT应用的适用性和合理性；通过蛋白质在β-CD亲水色谱柱与C18反相色谱柱上保留顺序的比较,发现两种模式下出峰顺序基本一致；比较“U”曲线的对称性和转变点,有利于针对溶质和固定相的性质制定不同的分离策略,同时也对新型HILIC/RPLC性质相匹配的双功能固定相的开发提供了理论依据,这也是HILIC/RPLC双保留机理对溶质在两模式下保留行为的指导意义。5. HILIC中溶质保留的热力学研究：从热力学分量的角度研究了溶质在HILIC模式下的保留过程,按照SDT两组线性方程得到不同温度下15种溶质的j和lgφ,发现j和lgφ的值随温度的变化很小；应用van’t Hoff作图法求得溶质保留总过程的焓变和熵变,说明溶质在HILIC模式下的保留过程是混乱度减小的放热过程；以不同温度下15种溶质的lgI和Z分别对1/T作图,证明了HILIC模式下1gI和Z与1/T也存在线性关系,在此基础上将溶质保留过程的热力学函数分解成吸附和解吸附分量的形式；对自由能变、焓变和熵变及其各自分量分别进行计算,结果表明三者通过分量加和得到的计算值能与实验值很好地吻合,同时从吸附和解吸附独立过程的角度解释溶质保留的色谱过程并给出定量的结果,这证明依据SDT将热力学函数分解成为吸附和解吸附两个独立分量的策略是合理并且可信的。