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乳酸菌是一类众所周知的食品级微生物“generally regarded as safe”(GRAS),作为一类重要的益生菌而被广泛应用于生命科学的各个领域。不仅可以直接用于各种乳制品的发酵剂,也可以用来生产酶制剂、抗菌肽或食品添加剂,甚至可研制活菌疫苗、产生抗体或抗原等。本论文以内蒙古传统乳制品中分离的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentumMG)为研究对象,对其进行了内源性质粒的普查和消除试验,建立了无内源性质粒的试验菌株,初步解决了质粒不相容性问题,为导入外源质粒DNA作基础。并应用PCR方法从L. fermentumMG基因组DNA中正确克隆出双组分调节基因RR的一段基因,克隆到敲除载体pRV300中,构建敲除载体pRV-RR。用既定电转化方法,将其转入L. fermentumMG中,破坏RR基因的完整性,并用16S rDNA基因测序和Southern blot方法鉴定突变体。最后对L. fermentumMG突变体进行了生理生化及益生特性试验。试验结果如下:1.以牛乳中分离的L. fermentumMG等6株乳酸菌为材料,应用3种不同抽提内源性质粒DNA的方法,普查6株不同乳酸菌中内源性质粒DNA,并对三种不同方法进行比较。结果表明:6株不同乳酸菌中均含有不同大小的内源性质粒DNA。3种方法中改进的Anderson-Mckay方法普查效果为最佳,其次为液氮反复冻融方法,最差者为改进的碱裂解方法。经过SDS-変温方法可以完全消除L. fermentumMG中大型内源性质粒DNA。2.应用PCR方法正确克隆出400bp的L. fermentumMG双组分调节作用的部分RR基因,进行A-T克隆和序列测序。结果表明:该基因与GenBank上的已知序列比较后同源性为100%。与不同乳酸菌株之间核苷酸的同源性均为70%以上,亲缘关系相近,与致病性病原菌株之间核苷酸的同源性均为50%以下,亲缘关系较远。但是各类菌株之间氨基酸的同源性除了个别区域有差异以外,其它区域有着惊人的相似;对重组敲除载体pRV-RR的准确性经EcoRI/HindIII双酶切鉴定,并以既定电转化条件(电压为1.5kv,时间为2.0ms)将敲除载体pRV-RR转入L. fermentumMG中,获得的突变体经16S rDNA基因序列比较,发现与野生型L. fermentumMG的同源性为100%,表明二者属同一菌株。进行Southern blot鉴定结果发现,突变体出现了4个强的信号,而野生型菌株则出现2个信号,表明敲除RR基因是成功的。3.对L. fermentumMG突变体(简称Lf-Mutant)以及野生型L. fermentumMG(简称Lf-Widy tipe)进行生理生化及益生菌特性试验并进行比较。其中糖发酵试验结果显示: Lf-Mutant对果糖和蔗糖的发酵能力明显下降,而对其他糖类则二者差异不大;耐盐试验结果显示:2.0%NaCl开始抑制Lf-Mutant,而不抑制Lf-Widy tipe的生长;4%NaCl则显著抑制Lf-Mutant,而不抑制Lf-Widy tipe的生长;只有6%NaCl才能抑制二者的生长;耐酸试验结果显示:在pH 4.5的条件下,Lf-Mutant和Lf-Widy tipe均生长良好;在pH 3.0的条件下,Lf-Mutant生长受抑制,而Lf-Widy tipe则可良好生长;耐胆盐试验结果显示:Lf-Mutant在含2.0%、1.8%、1.0%、0.3%不同胆盐浓度的MRS液体培养基中,12h之前其胆盐耐受性与Lf-Widy tipe基本一致,但是在12h之后则Lf-Mutant的胆盐耐受性显著高于Lf-Widy tipe,尤其是含高胆盐浓度者更为显著(分别为2.0%和1.8%);小鼠胃肠道体内粘附特性试验结果显示:粪便中排出的Lf-Mutant活菌数量显著高于Lf-Widy tipe,胃部和肠道部内容物和刮取物中的Lf-Mutant活菌数量显著低于Lf-Widy tipe。本试验为进一步从分子水平上解析L. fermentumMG益生作用的机理研究奠定了基础。