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背景和目的甲状腺癌是来源于滤泡上皮细胞的头颈部常见恶性肿瘤,其发病率约占内分泌系统恶性肿瘤的94%,在过去三十年里增高3倍多。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC),约占甲状腺癌的80%-85%,此类患者给予包括甲状腺叶手术切除、放射性碘治疗及辅以长期甲状腺激素抑制疗法等传统治疗后,5年生存率可达95%以上。然而,一部分PTC患者就诊时已经出现淋巴结转移及腺外侵犯,传统的治疗手段预后较差,10年生存率甚至小于10%。MicroRNAs(微小RNA,miRNAs)是一类高度保守的小分子非编码RNA,通过完全或不完全互补配对的方式与靶基因3′-UTRs(untranslated regions,非翻译区)结合,在转录后水平参与靶基因的调控,进而影响肿瘤的发生、发展。已有研究证实,miRNAs在PTC及多种肿瘤都存在异常表达,进一步提示了其在诊断、治疗和预后等方面的价值。本研究前期通过高通量的微阵列芯片技术,发现PTC患者癌组织miR-146b-5p的表达较癌旁显著升高,且具有统计学意义。樊友本等学者证实miR-146b-5p通过靶向ZNRF3从而促进人甲状腺乳头状癌细胞(TPC-1)转移。ET Kimura等学者发现miR-146b-5p通过靶向SMAD4增强TPC-1细胞的增殖。然而,miR-146b-5p对于PTC恶性表型转化调控的具体分子机制尚未阐明。卷曲螺旋结构域6(coiled-coil domain-containing 6,CCDC6)通过染色体重排的方式与RET基因组成嵌合体在部分PTC患者中表达为人们所认知。Angela Celetti等学者证实CCDC6作为ATM(ataxia telangiectasia-mutated gene,共济失调毛细血管扩张突变基因)的底物介导细胞应答DNA损伤,其缺失与甲状腺肿瘤发生密切相关。而且Angela Celetti等学者也证实了CCDC6的缺失与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的淋巴结转移密切相关。Alfredo Fusco等学者揭示了CCDC6表达下调通过增强CREB1(cAMP-response element binding protein 1,环磷腺苷效应元件结合蛋白1)的转录活性,导致甲状腺细胞的异常增殖,进而促进PTC的发生发展。另外Alfredo Fusco等学者也表明上调miR-130b-3p通过靶向CCDC6从而增强CREB1的活性进而促进甲状腺肿瘤形成。据此,我们推测野生型CCDC6可能作为新型的抑癌基因参与PTC的多种生物学过程,故假定miR-146b-5p通过下调CCDC6来促进PTC的恶性表型。本研究在PTC组织及细胞系中检测miR-146b-5p的表达及其与PTC临床参数的关系。体外实验中讨论了miR-146b-5p、CCDC6及两者的相互作用对甲状腺乳头状癌细胞系生物学行为的影响。在体内实验中,根据瘤体重量和大小来评估miR-146b-5p、CCDC6及两者的相互作用对TPC-1细胞增殖的影响。双荧光素酶报告实验验证miR-146b-5p与CCDC6的靶向关系。并在石蜡切片组织中检测CCDC6在PTC组织和相应癌旁正常甲状腺组织中的表达,且分析其表达与PTC临床特征的关系。据此,讨论miR-146b-5p和CCDC6的相互作用是否参与PTC的发生、发展,为靶向治疗PTC提供可靠的依据。材料与方法1、收集2015年3月-2015年11月在郑州大学第一附属医院行甲状腺癌切除术的甲状腺乳头状癌患者的新鲜组织87例及相应癌旁组织,所有患者术前均未行放化疗,取材均经告知患者并签署知情同意书。所有标本获取后均速浸泡于组织RNA常温保存液中(100mg组织需要1ml保存液),而后-80℃长期保存。组织标本由两名内分泌病理医师诊断,其中19例伴有腺外侵犯,39例伴有颈部淋巴结转移,47例TNM I期,13例TNM II期,4例TNM III期,23例TNM IV期。采用qRT-PCR的方法检测87例甲状腺乳头状癌及相应癌旁组织中miR-146b-5p的表达,分析其与临床参数的关系。另外,采用qRT-PCR的方法检测miR-146b-5p在甲状腺乳头状癌细胞系(TPC-1和BCPAP)和正常甲状腺细胞系(Nthy-ori 3-1)表达差异;2、通过抑制miR-146b-5p的表达,在体外实验中应用CCK-8试剂盒法和平板克隆形成实验、划痕修复实验、transwell小室侵袭实验、流式细胞凋亡和周期分析,分别来检测下调miR-146b-5p对TPC-1和BCPAP增殖、转移、侵袭、凋亡和细胞周期进程的影响;3、采用生物信息学推测并运用双荧光素酶报告实验验证CCDC6为miR-146b-5p的直接靶基因;4、通过慢病毒转染过表达CCDC6,在体外实验中应用CCK-8试剂盒法、划痕修复实验、transwell小室侵袭实验、流式细胞凋亡和周期分析,分别检测过表达CCDC6是减弱了由上调mi R-146b-5p导致的对TPC-1和BCPAP增殖、转移、侵袭、凋亡和细胞周期进程的影响;5、稳定抑制miR-146b-5p和稳定过表达CCDC6,通过裸鼠成瘤实验及瘤组织的免疫组织化学染色(IHC)评估miR-146b-5p及CCDC6对TPC-1细胞增殖的影响;6、采用IHC法检测185例甲状腺乳头状癌及相应癌旁石蜡切片组织中CCDC6的着色强度,并总结其与临床特征的关系;7、所有数据均采用SPSS 17.0及Prism 6.0统计分析。单因素方差分析和双侧t检验用于定量资料的比较。卡方检验用于定性资料的比较。所有数据以均数±标准误(`X±SEM)表示。α<0.05具有统计学意义。结果1、miR-146b-5p在PTC组织中的表达量较癌旁正常甲状腺组织升高2.20倍(P<0.05),在女性患者的表达量是男性患者的1.28倍(P<0.05),且其表达与腺外侵犯和TNM分期呈明显正相关(P<0.05),与颈部淋巴结转移无相关性(P>0.05);2、(1)在TPC-1细胞中,miR-146b-5p inhibitor组72h吸光度值下降为1.18±0.05,划痕宽度24h内变化不明显,平均穿膜细胞数降低为26个,S期下降至(16.02%),较inhibitior NC组相比,inhibitor组均显著降低(P<0.05);凋亡率为(1.73%±0.09)(P>0.05);(2)、在BCPAP细胞中,miR-146b-5p inhibitor组72h吸光度值下降为1.12±0.04,划痕宽度24h内变化不明显,平均穿膜细胞数降低为28个,S期下降至(13.63%),较inhibitior NC组相比,inhibitor组均显著降低(P<0.05);凋亡率为(2.53%±0.18)(P>0.05);3、miR-146b-5p与CCDC6的3′UTR中保守区序列1742-1749和非保守序列1920-1927存在直接靶定的关系;4、(1)在TPC-1细胞中,miR-146b-5p组72h吸光度值升高为2.17±0.13,划痕宽度24h内明显愈合缩短,平均穿膜细胞数升高为109个,S期上升至(24.58%),较mi R-NC组相比,miR-146b-5p组均显著升高(P<0.05);而共转染mi R-146b-5p+Lv-CCDC6,72h吸光度值下降为1.54±0.21,划痕宽度24h内明显愈合较之减缓,平均穿膜细胞数降低为63个,S期下降至(20.21%),较miR-146b-5p组均显著降低(P<0.05);(2)在BCPAP细胞中,mi R-146b-5p组72h吸光度值升高为3.04±0.07,划痕宽度24h内明显愈合缩短,平均穿膜细胞数升高为112个,S期上升至(25.33%),较mi R-NC组相比,miR-146b-5p组均显著升高(P<0.05);共转染miR-146b-5p+Lv-CCDC6,72h吸光度值下降为2.07±0.04,划痕宽度24h内明显愈合较之减缓,平均穿膜细胞数降低为57个,S期下降至(20.68%),较miR-146b-5p组均显著降低(P<0.05);5、miR-146b-5p inhibitor组28天后瘤体积为366.5士37.5mm3,瘤体重量为408.5士10.71mg,均明显低于inhibitior NC组(P<0.05);CCDC6过表达组28天后瘤体积为326.5士19.5mm3,瘤体重量为363.1士31.97mg,均明显低于NC组(P<0.05);6、CCDC6过表达组IHC染色CCDC6的着色强度高于NC组,且miR-146b-5p inhibitor组瘤组织IHC染色CCDC6的着色强度高于inhibitior NC组(P<0.05);7、PTC石蜡切片组织IHC染色显示,CCDC6主要表达于胞核和胞质中,癌旁组织明显高于癌组织(图3.1),且与PTC的腺外侵犯、颈部淋巴结转移和TNM分期明显相关(P<0.05)(详见表4.1)结论1、在PTC组织及甲状腺乳头状癌细胞系中检测到miR-146b-5p高表达,与前期芯片结果相一致,且miR-146b-5p表达量与腺外侵犯及TNM分期正相关。在体外和体内实验中,抑制miR-146b-5p阻碍了TPC-1和BCPAP细胞的恶性表型,初步证实了miR-146b-5p在PTC的发生、发展中扮演致癌基因的角色;2、双荧光素酶报告实验验证了CCDC6为miR-146b-5p的直接靶基因。在体外和体内实验中,干扰下调CCDC6减弱了抑制miR-146b-5p对TPC-1和BCPAP细胞的恶性表型的阻碍作用;3、在PTC组织及石蜡切片中检测到CCDC6的表达缺失或减弱,总结其与PTC临床特征的关系,初步证实了CCDC6在PTC发生、发展中抑癌基因的角色。