一、研究背景目前世界上每年有150万婴幼儿因需进行外科手术或介入治疗等各种原因而接受全身麻醉。长期以来,全身麻醉是否影响婴幼儿的智力发育一直是患儿家属十分关注的问题。传统观念认为,只要麻醉过程不存在脑缺氧等因素就不会影响婴幼儿智力的发育。但近年来的研究发现,动物出生前后阶段是中枢神经生长发育的高峰期,有大量神经细胞增殖、大量树状突起生发和大量突触连接生成,形成复杂的神经网络。此时期中枢神经对周围微环境非常敏感,容易遭受干扰而影响其正常发育,并导致远期精神行为异常改变。鉴于全身麻醉药物对中枢神经系统的强力抑制作用,以及在新生儿或婴幼儿正常麻醉期间诱发神经毒性的可能,已经引起大家对小儿麻醉安全性的质疑。氯胺酮为N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体拮抗剂,是临床唯一具有显著镇痛作用的静脉全麻药,也是唯一被美国FDA认可的NMDA受体拮抗剂,被广泛应用于婴幼儿手术的麻醉。NMDA受体是一种离子通道型谷氨酸能受体,是一种具有许多不同变构调控位点并对Ca2＋高度通透的配体门控性离子通道。在中枢神经系统,主要分布在大脑皮层及海马,尤其以海马最为丰富。有研究发现NMDA受体与中枢神经系统的发育密切相关,控制神经元的分化、迁移和存活,并在学习、记忆的形成和维持过程中发挥重要作用。许多研究已证实,在脑发育关键期NMDA受体保持适度的兴奋对大脑神经元的存活有着重要意义。如果改变NMDA受体的活性可影响中枢神经系统的发育和功能。Olney等对新生大鼠使用NMDA受体拮抗剂(MK-801、PCP)后,发现海马、下丘脑等多个重要脑区的神经元大量凋亡。凋亡的严重程度及分布区域和年龄呈相关性,生后5-7d大鼠的凋亡情况最严重,而生后21d的大鼠并未出现明显神经元凋亡,说明了NMDA受体的神经毒性作用具有时限性,且与大鼠突触形成的高峰期是重叠的。1999年,Ikonomidou等在《科学》杂志报道了包括MK801和氯胺酮在内的NMDA拮抗剂引起神经毒性的证据。随后,他的研究小组和其他研究者证实了许多麻醉药(包括氧化亚氮、异氟醚和氯胺酮)出现诱导神经元凋亡,特别是幼年啮齿类大脑凋亡改变的现象。然而,氯胺酮引起神经元凋亡与神经功能损害的确切机制目前还不清楚。既往研究表明,在大鼠生长发育期注射氯胺酮会导致海马组织的NMDA受体表达上调,引起神经兴奋毒性增加,导致发育期神经元广泛的剂量依赖性的凋亡,并可对其远期学习记忆能力产生影响。此外,氯胺酮作为NMDA受体的非竞争性拮抗剂,可以通过作用于NMDA受体PCP结合位点,阻断与NMDA受体祸联的钙通道,减少钙离子内流,降低细胞内钙离子浓度,从而拮抗谷氨酸、天冬氨酸等兴奋性氨基酸对神经系统发育的调节。Andjus等已证实氯胺酮降低神经元细胞内钙离子浓度的作用。氯胺酮导致细胞内钙离子浓度降低可能抑制丝裂素活化蛋白激酶的激活,从而抑制神经干细胞的增殖。祖国医药文献记载,麝香具有芳香开窍、醒脑回苏、镇心安神等作用。现代研究也表明,在局灶性脑缺血损伤模型中,麝香酮可减少NMDA受体表达,减轻兴奋性氨基酸毒性损伤。另有研究发现,麝香酮可显著提高痴呆大鼠钙离子的摄取量,增加痴呆鼠细胞内可用性钙从而发挥抗痴呆作用。基于上述研究,我们推测,麝香酮也许能通过减少氯胺酮导致的海马NMDA受体表达的上调,增加海马神经细胞内钙浓度,从而减轻氯胺酮所致发育期海马神经元凋亡,改善神经功能。因此,本研究选用新生7天SD大鼠,观察麝香酮对氯胺酮麻醉后新生鼠海马神经元凋亡以及NMDA受体表达的影响,并通过Morris水迷宫实验,研究其对氯胺酮麻醉后新生大鼠学习记忆能力的变化。随后,我们通过体外细胞培养技术,观察不同剂量的麝香酮对氯胺酮处理后海马神经元凋亡和形态的影响,并通过激光共聚焦技术观察细胞内钙浓度的变化,以期找出其可能相关机制,为进一步基础及临床研究提供理论依据。二、方法首先选取新生7d的SD大鼠,分为对照组和氯胺酮组。氯胺酮组大鼠腹腔注射20mg/kg氯胺酮,间隔90min,共计5次。对照组在相应时间点腹腔注射等体积的生理盐水。最后一次给药后10min,经左心室采血行血气分析。随后取新生7d的SD鼠105只,随机分为5组,每组21只。对照组：腹腔注射生理盐水；氯胺酮组：腹腔注射氯胺酮20mg/kg共5次,间隔90分钟；低剂量麝香酮组：腹腔注射麝香酮0.5mg/kg,同时腹腔注射氯胺酮20mg/kg共5次,间隔90分钟；中剂量麝香酮组：腹腔注射麝香酮1mg/kg,同时腹腔注射氯胺酮20mg/kg共5次,间隔90分钟；高剂量麝香酮组：腹腔注射麝香酮2mg/kg,同时腹腔注射氯胺酮20mg/kg共5次,间隔90分钟。各组取12只灌注固定,行神经元凋亡检测和NMDA受体免疫组化；3只取海马提蛋白westernblot检测NMDA-2B。另30只大鼠饲养至第28d,行Morris水迷宫实验。体外培养5d的海马神经元经鉴定后,随机分为空白对照组：正常培养,未作处理,但与实验组同时换液；氯胺酮组：培养细胞中加入用培养液稀释成1000μmol/l的氯胺酮；低剂量麝香酮组：培养细胞中加入用培养液稀释成1000μmol/l的氯胺酮和0.125g/1的麝香酮；中剂量麝香酮组：培养细胞中加入用培养液稀释成1000μmol/1的氯胺酮和0.25g/1的麝香酮；高剂量麝香酮组：培养细胞中加入用培养液稀释成1000μmol/l的氯胺酮和0.5g/1的麝香酮。24h后,分别应用DAPI观察凋亡细胞数,MTT法检测细胞活性,图像分析软件测量树突分枝总长度和一级树突分枝数。另外,应用激光共聚焦技术观察麝香酮对海马神经元细胞内钙浓度的影响。三、结果1.血气分析对照组和氯胺酮组大鼠的pH值分别为7.43±0.05和7.41±0.01,无统计学差异(t=4.327,P=0.553); PO2分别为86.00mmHg±8.66mmHg和47.05mmHg±2.87mmHg,无统计学差异(t=1.765, P=0.755);SO2分别为96.50%±1.50%和96.25%±0.43%,无统计学差异(t=3.128,P=0.791)。对照组和氯胺酮组大鼠的PCO2分别为40.73mmHg±3.73mmHg和47.05mmHg±2.87mmHg.与对照组相比,氯胺酮组大鼠的PCO2略有升高,但并无统计学差异(t=1.663,P=0.059)。2.海马CA3区神经元凋亡五组大鼠海马CA3区神经元凋亡细胞数密度有显著差异(F=O.175,P=0.010)。与对照组相比,氯胺酮组大鼠的凋亡细胞数密度显著增加(P=0.004)。与氯胺酮组相比,低剂量麝香酮组凋亡细胞数密度有所降低,有统计学差异(P=0.023),中剂量麝香酮组凋亡细胞数密度明显降低,差异有统计学意义(P=0.003),高剂量麝香酮组则无显著差异(P=0.373)。3.海马NMDA-2B受体五组大鼠海马CA3区神经元凋亡细胞数密度有显著差异(F=0.510,p-<0.001)。氯胺酮组NMDAR-2B的灰度值显著高于对照组(P<0.001)；与氯胺酮组相比,低剂量、中剂量和高剂量麝香酮组NMDAR-2B的灰度值均显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。4.Morris水迷宫从第2d开始,逃逸潜伏期出现显著的统计学差异(P<0.001)。氯胺酮组大鼠的逃逸潜伏期显著长于空白对照组,而与氯胺酮组相比,各剂量麝香酮组大鼠的逃逸潜伏期差异均无统计学意义(P>0.05)。各组间目的象限路程百分比的差异有统计学意义(F=3.523,P=0.021)。与对照组相比,氯胺酮组大鼠目的象限路程百分比显著缩短,差异有统计学意义(P=0.007)。与氯胺酮组相比,各剂量麝香酮组大鼠的目的象限路程百分比均无统计学差异(P>0.05)。各组间目的象限时间百分比的差异有统计学意义(F=3.516,P=0.021)。与对照组相比,氯胺酮组大鼠目的象限时间百分比显著延长,差异有统计学意义(P=0.005)。与氯胺酮组相比,各剂量麝香酮组大鼠的目的象限时间百分比均无统计学差异(P>0.05)。5.麝香酮对氯胺酮处理后海马神经元凋亡的影响各组间差异存在统计学意义(F=37.502,P<0.001)。与正常对照组相比,氯胺酮组凋亡细胞数明显增加(P<0.001)。与氯胺酮组相比,低剂量(P=0.003)和中剂量麝香酮组(P<0.001)凋亡数显著减少,高剂量组无显著差异(P=0.192)。6.MTT法测定细胞活性与对照组相比,经氯胺酮处理后OD值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与氯胺酮组相比,低剂量和中剂量组OD值显著上升,差异有统计学意义(P<0.05),但高剂量麝香酮组差异无统计学意义(P>0.05)。7.麝香酮对海马神经元细胞内钙浓度的影响添加0.25g/1麝香酮后,荧光强度显著增强,差异有统计学意义(P<0.001)。8.麝香酮对氯胺酮处理后海马神经元形态的影响与对照组相比,氯胺酮组海马神经元的一级树突分枝数和树突分枝总长度均明显减少,差异有统计学意义(F=0.694,P<0.001)。与氯胺酮组相比,低剂量、中剂量和高剂量麝香酮组海马神经元的一级树突分枝数和树突分枝总长度均无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。四、讨论本研究发现,重复注射20mg/kg氯胺酮后,新生乳鼠的pH值、氧分压和氧饱和度无明显变化。二氧化碳分压虽略有升高,但从统计结果来看,并无统计学差异。因此,我们认为重复注射20mg/kg氯胺酮并不会导致新生大鼠缺氧和二氧化碳蓄积,该动物模型可用于评价氯胺酮对神经元发育影响的实验研究。为确定麝香酮是否对氯胺酮麻醉后大鼠海马神经元产生何种影响,我们选取新生7d大鼠,重复注射20mg/kg氯胺酮共计5次,间隔90min。结果发现,氯胺酮组大鼠海马NMDAR-2B的表达明显增加,预先注射麝香酮的大鼠,则可见其表达上调的NMDA受体呈剂量依赖性的表达减少。在进行凋亡研究时,我们发现氯胺酮组大鼠的海马神经元凋亡明显增加,低、中剂量的麝香酮可减少氯胺酮所引起的神经元凋亡；然而,更高剂量的麝香酮反而引起凋亡增加。由此我们推测,氯胺酮引起NMDA受体表达上调也许并非导致神经元兴奋性毒性的唯一机理,麝香酮能使海马NMDA受体表达下调,从而减少了细胞凋亡,但更高剂量的麝香酮非但没有起到更好的保护作用,反而使凋亡细胞增加,具体原因不明。随后,在Morris水迷宫试验中,我们发现对1周龄大鼠重复注射氯胺酮,在麻醉后4周观察到大鼠水迷宫逃逸潜伏期延长,探索时间缩短,提示麻醉大鼠的空间辨别学习和记忆能力出现下降。而本研究所采用的各种剂量麝香酮均不能改善氯胺酮所致学习记忆能力的下降。我们认为,氯胺酮导致大鼠认知功能下降的主要原因包括NMDA受体表达增强后兴奋性神经毒性以及随后引起的神经元大量凋亡。一定剂量的麝香酮虽能减少神经元凋亡,降低NMDA受体表达,却不能改善氯胺酮所致学习记忆功能减退。这表明神经发育关键期神经元凋亡的多少可能会影响其成年后学习记忆能力,但学习记忆能力的大小同时受其它多种因素影响。为继续探寻麝香酮对氯胺酮麻醉后海马神经元发育不同影响的机制,我们进行了体外实验。结果发现,向海马神经元中加入0.25g/1麝香酮后,可见细胞内Ca2＋浓度迅速显著升高,据此我们推测,麝香酮之所以能减少氯胺酮所致海马神经元凋亡,除与之能减少NMDA受体表达上调有关外,其促进钙离子内流,增加细胞内可用钙,从而激活下游正常的信号通路也许是部分原因。但过高剂量的麝香酮也许会促进细胞内钙离子浓度过度升高,细胞内钙超载,反而会促进海马神经元凋亡。氯胺酮可导致海马神经元树突发育受损,影响神经网络的形成,从而影响其成年后学习记忆功能。麝香酮并不能减轻氯胺酮对树突发育的毒性作用,所以前述实验中,麝香酮组大鼠的水迷宫成绩未见明显改善。五、结论麝香酮能减少氯胺酮麻醉后新生大鼠NMDA受体表达的上调,促进钙离子内流,并在一定剂量范围内减少海马神经元凋亡；但过高剂量的麝香酮可引起凋亡神经元增加。氯胺酮可引起新生神经元一级树突分枝数减少和树突分枝总长度缩短,麝香酮对氯胺酮树突发育的毒性作用无影响。各剂量的麝香酮均不能改善氯胺酮引起的大鼠学习记忆能力的下降。