第一部分 高压氧对微波辐射致大鼠脑损伤的保护作用研究目的微波是指频率300 MHz～300 GHz的电磁波,现已经广泛应用于通讯、航空、医疗和军事等多个领域,给人类带来便利的同时,其辐射损伤效应也逐渐受到关注,其中中枢神经系统对微波辐射最为敏感,而针对微波辐射损伤的防治措施相对比较少见。本研究拟建立微波辐射致脑损伤的动物模型,观察高压氧对微波辐射致大鼠脑损伤的保护作用,为高压氧治疗微波辐射脑损伤进入临床使用提供依据。方法1、将二级雄性Wistar大鼠100只,随机分为4组：正常对照组、高压氧(HBO)对照组、辐射组、高压氧(HBO)治疗组,每组25只。采用30 mW/cm2的微波对大鼠进行全身均匀辐射,辐射时间为15 min/天,共3天,辐射后次日给予1.6ATA高压氧治疗,每日1次,连续14天。2、各组大鼠于微波辐射前进行定位航行实验训练3d,以检测实验大鼠的学习能力。辐射后Id、2d、3d、7d、14d、21d进行定位航行实验采集平均潜伏期(MEL),以检测实验大鼠的学习和空间记忆能力的变化。3、辐射后6h、7d、14d、21d称量大鼠体重,每组5只,经腹腔注射1%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后,直接断头活杀,取其脑组织,分离其海马组织,经苏木素-伊红(HE)染色,采用光镜对大鼠海马形态结构进行观察。4、实验动物分别于辐射后7d和14d称量体重,经腹腔注射1%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后,直接断头活杀,取1mm3海马组织,经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,通过透射电镜对大鼠海马超微结构进行观察。5、统计学处理：本实验计量资料用均数±标准差表示,对各组间大鼠平均潜伏期采用重复测量设计的方差分析进行比较,按α=0.05检验水平,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、大鼠学习和记忆能力的变化：30mW/cm2微波辐射后1-14d,辐射组大鼠平均逃避潜伏期明显高于正常对照组(p<0.05),在微波辐射后7d和14d, HBO治疗组与辐射组比较,平均逃避潜伏期明显缩短(p<0.05),HBO治疗组与正常对照组比较,平均逃避潜伏期无明显差异(p>0.05)。HBO对照组与正常对照组比较,平均逃避潜伏期无明显差异(p>0.05)。2、大鼠海马组织结构的改变：30mW/cm2微波辐射后6h,大鼠海马神经元光镜下可见胞核固缩、深染,胞浆嗜酸性增强,血管周组织间隙增宽,血管水肿；辐射后7d病变较6h加重；辐射后14d病变呈恢复状态,至21d仍未完全恢复正常,部分神经元仍见变性,血管轻度水肿。HBO治疗组辐射后7d部分神经元固缩、深染,血管周间隙增宽,与辐射对照组比,固缩、深染神经元有所减少,水肿减轻,海马组织损伤呈恢复状态,至辐射后21d已基本恢复正常。3、大鼠海马超微结构的改变：辐射组受辐射后7d,可见海马神经元线粒体肿胀、局部空化,嵴断裂及溶解,粗面内质网扩张,核膜增宽,胞浆内可见次级溶酶体,甚至可见嗜神经现象,即胶质细胞吞噬退变的神经元;突触间隙模糊,突触前膜囊泡减少,突触后膜致密物增加；HBO治疗组病变较轻；正常对照组和HBO对照组大鼠海马超微结构基本正常。结论1、30mW/cm2微波辐射可对大鼠脑造成一定的损伤,表现为大鼠的学习和记忆能力的下降,海马组织结构和超微结构的损伤。2、1.6 ATA高压氧对微波辐射所致的大鼠脑损伤有一定的保护作用。3、1.6 ATA高压氧不会对大鼠造成损伤。第二部分高压氧对微波辐射致大鼠脑损伤的保护作用机制研究目的第一部分研究发现,高压氧对微波辐射所致大鼠脑损伤有一定的保护作用,而其作用机制暂不清楚。微波辐射可引起脑能量代谢障碍这一学说已被大量实验证实。高压氧是可以改善脑微循环,提高氧分压,促进神经元细胞能量代谢,我们推测,高压氧可能是通过改善微波辐射后大鼠脑微循环,纠正脑能量代谢障碍而起作用的。为此,本部分研究采用酶联免疫法检测大鼠海马线粒体多种酶的活性,以及免疫组织化学染色检测低氧诱导因子(HIF-1α)蛋白的表达,对高压氧可能的脑保护机制进行初步探讨。方法1、二级雄性Wistar大鼠100只,随机分为4组：正常对照组、HBO对照组、辐射组、HBO治疗组,每组25只。采用30mW/cm2的微波对大鼠进行全身均匀辐射,辐射时间为15min/天,共3天,辐射后次日给予1.6ATA高压氧治疗,每日1次,连续14天。2、分别于辐射后6h、7d、14d、21d称量大鼠体重,每组5只,经腹腔注射1%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后,直接断头活杀,取其脑组织,分离其海马组织。3、按海马组织重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水,超声粉碎机进行粉碎制成10%制备海马组织匀浆。4、考马斯亮蓝法测定海马组织蛋白含量。5、酶联免疫法测定海马组织中乳酸脱氢酶(LDH)、Na+-K+-ATP酶、单胺氧化酶(MAO)活性的变化。6、于辐射后6h、7d、14d和21d活杀大鼠,取其脑组织,分离其海马组织,制成石蜡切片,免疫组织化学染色观察各组大鼠海马低氧诱导因子(HEF-1α)的表达；采用Image-Pro Plus图像分析软件,分别计算各组海马相同面积内累积光密度值(IOD)。7、统计学处理：本实验计量资料用均数±标准差表示,对各组间数据比较采用完全随机设计的方差分析进行比较,按a=0.05检验水平,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、微波辐射后6h,各组间大鼠海马组织LDH活性无明显差异。辐射后7d-21d,辐射组LDH活性明显升高,与其它各组相比,差异有统计学意义(p<0.05),随着时间变化,呈现先逐渐升高后降低的变化趋势。HBO治疗组在辐射后第7d LDH活性有升高趋势,但与正常对照组无明显差异(p>0.05),明显低于辐射组,差异有统计学意义(p<0.05)。辐射后第14d, HBO治疗组LDH活性仍呈升高趋势,与正常对照组相比差异有统计学意义(p<0.05),但低于辐射组(p<0.05)。至第21d, HBO治疗组LDH活性基本恢复正常。HBO对照组在所有时间点,LDH活性未见明显升高,与正常对照组无显著性差异(p>0.05)。2、辐射后6h,各组别Na+-K+-ATP酶活性变化不大,无明显差异。辐射组于辐射后7d-14d,Na+-K+-ATP酶活性明显降低,与其它各组相比,差异有统计学意义(p<0.05),至辐射后第21d,其活性呈现升高趋势,但仍低于正常水平。HBO治疗组在Na+-K+-ATP酶活性在所有时间点均无明显下降,与正常对照组相比,差异无显著性(p>0.05)。3、辐射组MAO活性在各个时间点明显升高,与正常对照组相比,差异有显著性(p<0.05),在7d-21d与HBO治疗组对比,差异有显著性(p<0.05),且在第21d时仍未恢复正常。HBO治疗组在在7d-21d, MAO活性基本恢复正常,与正常对照组相比,无明显差异(p>0.05),但显著低于辐射组(p<0.05)。4、光镜下观察大鼠海马免疫组织化学染色HEF-1α的表达,阳性细胞表现为出现明显的棕黄色或黄褐色颗粒。正常对照组和HBO对照组在各时间点基本无HIF-1α的表达,辐射组和HBO治疗组在辐射后6小时有即有表达,两组IOD值高于正常对照组(p<0.05)。至第7天,辐射组海马神经元大量表达HIF-1α,而HBO治疗组只有少量表达,辐射组与HBO治疗组对比,差异有显著性(p<0.05),第14d-21d,两组HIF-1α的表达呈减少趋势,HBO治疗组基本恢复正常,与正常对照组相比(p>0.05),但辐射组仍有表达,明显高于其它各组(p<0.05)。结论1、微波辐射可致大鼠海马线粒体能量代谢障碍、HIF-1α表达增加,造成脑损害。2、高压氧可能通过改善微波辐射所致的海马线粒体能量代谢障碍、抑制HIF-1α表达起到脑保护作用。