背景和目的：口腔颌面部的骨缺损多由良恶性肿瘤、手术、创伤以及炎症(例如牙周炎、骨髓炎)等引起,不但导致患者的面部畸形和功能障碍,还会产生严重的心理、社交障碍,影响患者的生活质量。理想的骨缺损修复是实现骨组织的再生,恢复健康骨组织的解剖结构和生理功能。骨损伤的愈合是一个复杂的组织学和生物化学变化过程,多种细胞和分子参与其中。在损伤后的第一个24小时内,血小板、巨噬细胞以及其他炎症细胞释放各种细胞因子和生长因子,募集间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)到受损区域。这些间充质干细胞进一步增殖分化为成骨细胞和成软骨细胞,最终导致细胞外基质的的积聚及矿化。间充质干细胞属于多能干细胞,具有自我复制和多向分化能力,可以在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。间充质干细胞主要存在于结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。参与骨再生的间充质干细胞可能来源于缺损临近组织例如骨膜、骨髓、血管壁等,也可能由较远区域的骨髓组织通过血液循环迁移至此,另外外周血中也存在少量间充质干细胞。间充质干细胞的激活、募集对骨损伤后的再生至关重要。骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)是一种多能干细胞,具有很强的自我更新能力,能够分化为多种中胚层组织如脂肪组织、骨组织、软骨、韧带、肌肉等。作为成骨前体细胞,骨髓基质干细胞在骨组织形成过程中发挥着重要作用。干细胞通过血液循环穿过血管内皮细胞甚至是经过长距离的迁移到达特定部位的过程称之为“归巢”。大量研究表明,间充质干细胞会选择性的归巢至机体任何损伤部位以发挥治疗作用,确切机理尚不清楚。尽管越来越多的证据显示细胞因子和趋化因子(以及他们的受体)可能在间充质干细胞的动员、归巢过程中发挥着重要的作用,但鲜有研究关注干细胞归巢与全身健康状况的关系。高脂血症与骨质疏松密切相关。高脂血症通过抑制骨形成和促进骨吸收导致骨质疏松,氧化应激和脂质过氧化在其中起重要作用。脂质氧化物能够促进成骨细胞的凋亡以及破骨细胞的分化；骨髓基质干细胞在体外经过低密度脂蛋白的氧化产物诱导,能够分化为脂肪细胞而不是成骨细胞。目前高脂血症对骨创伤愈合的影响还不明确,但已有研究显示高脂血症抑制骨创伤部位的新骨形成。因此我们推测：除了对骨代谢的负性影响外,高脂血症还可能会通过干扰间充质干细胞的归巢行为影响骨创伤的愈合。本实验利用载脂蛋白E基因敲除(ApolipoproteinE deficient, ApoE-/-)小鼠建立高脂血症模型。在小鼠下颌骨制造骨缺损后,经过小鼠尾静脉注射携带绿色荧光蛋白的骨髓基质干细胞,利用免疫荧光显微镜观察、免疫组化染色、组织学观察以及组织形态学分析等方法首次探讨了高脂血症对系统移植的骨髓基质干细胞的归巢和骨再生的影响。材料与方法：1.骨髓基质干细胞的分离、培养、鉴定和转染本实验采用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6J小鼠来源的骨髓基质干细胞；采用换液、粘附-消化-传代-粘附的方法获得高纯度的骨髓基质干细胞。.通过流式细胞仪检测第4代骨髓基质干细胞表面抗原CD34, CD44, CD45, CD29的表达。成纤维细胞克隆形成单位(CFU-F)实验检测骨髓基质干细胞的克隆形成能力。三向分化能力鉴定：在体外以0.1μM地塞米松、10mM β-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸磷酸盐诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,4周后进行茜素红染色鉴定钙化结节的形成；以1μM地塞米松、200μ M吲哚美辛、10μM胰岛素和0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化,2周后用油红0(0il Red0)染色检测脂肪滴的形成；以10ng/ml转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、50nM抗坏血酸磷酸盐、0.1μM地塞米松诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化,3周后通过甲苯胺蓝染色检测软骨特异性蛋白聚糖的形成；体外分化诱导实验以不含诱导因子的完全培养基培养的同代骨髓基质干细胞为对照。利用携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的慢病毒载体感染骨髓基质干细胞,经G418筛选阳性细胞后体外扩增备用。2.高脂血症模型的建立及小鼠骨髓基质干细胞的移植7周龄ApoE-/-小鼠和C57BL/6J小鼠均饲以高脂饮食,每周监测体重,并于高脂喂养4周后检测血脂水平以确定高脂模型是否建立。小鼠13周龄时,在其右侧下颌骨制造直径为1.5mm的缺损；收集体外扩增的GFP+骨髓基质干细胞并经尾静脉注射入小鼠体内,每只小鼠接受的细胞移植量为1×106个,对照组仅注射不含血清的α-MEM培养液。术后1,2,4周处死小鼠,经4%多聚甲醛循环内固定后解剖出小鼠右侧下颌骨。下颌骨标本经过外固定、EDTA脱矿后,进行常规包埋切片。切片脱蜡水化后,用DAPI染色液行细胞核染色并通过荧光显微镜直接观察GFP+细胞在体内的迁移与分化,利用图像处理软件检测移植细胞的归巢效率,评价高脂血症对移植细胞归巢的影响；免疫组化染色的方法检测携带GFP的骨髓基质干细胞在骨缺损区的分布及分化；组织切片经苏木素一伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色、马松三色(Masson’s Trichrome, MT)染色后在光学显微镜下观察骨缺损区组织学变化,并利用图像分析软件测量新骨形成面积以评价高脂血症对骨再生的影响。结果：1.骨髓基质干细胞的分离、培养、鉴定和感染利用全骨髓贴壁法可成功分离骨髓基质干细胞,原代细胞的纯度较低,经过2-3次传代之后可以获得纯化,细胞大小、形态稳定。流式细胞仪检测P4代细胞表面标记发现骨髓基质干细胞表达CD44(96.48%),CD29(97.98%)；而不表达CD31(0.71%)和CD45(5.72%)。成纤维细胞克隆形成单位实验显示骨髓基质干细胞具有较强的克隆形成能力。小鼠骨髓基质干细胞骨向诱导4周后进行茜素红染色,发现有致密红染的细胞外基质沉积和矿化结节的形成；脂向诱导2周后进行油红0染色,可见大量红色脂滴形成；成软骨诱导3周后进行甲苯胺蓝染色,观察到细胞胞质内有异染蓝色,以上结果提示本实验分离培养的骨髓基质干细胞具有多向分化的潜能。携带GFP基因的慢病毒感染骨髓基质干细胞48小时后,荧光显微镜下可观察到大部分细胞发出明亮的绿色荧光,96小时达到最强；感染后的细胞形态没有明显改变,生长状态良好；经过G418筛选获得的GFP+骨髓基质干细胞可大量扩增,GFP随细胞传代持久、稳定表达。2.高脂血症模型的建立及小鼠骨髓基质干细胞的移植ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养4周时的血脂水平较C57BL/6J小鼠明显升高,其中血清总胆固醇水平升高了8.1倍,低密度脂蛋白水平升高了14.4倍,而高密度脂蛋白和甘油三酯的血清水平仅升高了2.3和1.7倍,说明高脂血症动物模型成功建立；实验期间两种小鼠的体重持续增长,没有明显差异。免疫荧光显微镜直接观察和免疫组化染色分析显示,术后1周骨缺损部位GFP+细胞数量达到高峰,细胞形态表现为成纤维细胞样；2周和4周时GFP+细胞的数量逐渐减少,在骨缺损边缘和新骨形成区检测到GFP+成骨细胞；通过对GFP+细胞数进行计数统计并计算归巢率,发现在相同的时间点高脂血症小鼠的移植细胞归巢率明显低于C57BL/6J小鼠。HE、MT染色后的组织学观察发现术后1周所有动物的骨缺损区均充满纤维结缔组织,没有新骨形成；术后2周,骨缺损中央可见骨岛形成；术后4周,可观察到缺损区有大面积新骨形成。组织形态学分析显示C57BL/6J小鼠比ApoE-/-小鼠表现出更强的新骨生成能力,而接受BMSCs移植的小鼠其新骨形成面积比未接受细胞移小鼠相对较多,比较各组的新骨形成面积均具有统计学意义(p<0.05)。结论：1.全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞操作简单,易于掌握；细胞经过换液、2-3次传代后获得纯化。分离培养获得的小鼠骨髓基质干细胞形态稳定,具备干细胞特性：拥有较强的克隆形成能力并能诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。携带GFP基因的慢病毒能够有效的感染骨髓基质干细胞,感染后的骨髓基质干细胞能够持久稳定表达GFP,并于体外大量扩增。2.经小鼠尾静脉移植的骨髓基质干细胞能够归巢至下颌骨缺损区,且部分分化为成骨细胞参与和促进局部新骨的形成,但高脂血症会降低其归巢效率并削弱其对骨组织再生的促进作用。