硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)作为免疫抑制剂，在临床上用于治疗炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)。　　 AZA为前体药，本身无细胞毒性及免疫抑制作用，进入体内后经谷胱甘肽硫转移酶(glutathione-S-transferases，GSTs)代谢为无治疗活性的6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)，后者进一步代谢后生成6-TGNs从而发挥药效。中间产物6-巯基单磷酸肌苷(6-thioinosine monophosphate，6-Thio-IMP)容易转化成6-巯基三磷酸肌苷(6-thioinosine triphosphate，6-Thio-ITP)6-TITP。三磷酸肌苷焦磷酸酶(Inosine triphosphate pyrophosphohydrolase，ITPA)能将6-TITP催化再重新生成6-TIMP，保证活性代谢途径继续进行。6-MP可由硫嘌呤甲基转移酶(thiopurine S-methyhransferase，TPMT)，黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)代谢生成无活性代谢产物。　　 AZA治疗中大约有15％-38％的患者发生不良反应，目前有研究认为TPMT基因型突变导致的活性降低可预测AZA不良反应的发生情况。然而TPMT的基因突变频率在中国人群中很低，因此不足以解释中国人群中AZA代谢巨大的个体差异。　　 AZA首先在GSTs催化下结合谷胱甘肽(glutathione，GSH)生成6-MP开始活性代谢途径，所以GSTs为AZA体内代谢的首个酶，具有非常重要的作用。大量研究显示GSTs的突变率较高，且GSTs基因突变引起的酶活性的改变可能与AZA代谢的个体差异相关。如有研究发现携带缺失突变GSTM1的意大利青年IBD患者用AZA治疗后出现不良反应的风险低于野生型患者。另有研究指出，GSTP1基因突变与中国汉族健康人群中的活性的变化有相关性。然而，这种相关性是否同样在IBD患者中存在，个体酶活性的差异对AZA代谢导致的不良反应的个体差异的影响尚未有报道。　　 ITPA可减少6-TITP在细胞内的蓄积，从而减少毒副反应。对体外样本基因型与表型相关性的分析显示，ITPA 94C＞A杂合子活性降低至野生型的25％～30％，突变纯合子导致活性缺失或极低。IVS2+21A＞C等位基因突变纯合子活性降低至野生型的60％。目前，对ITPA基因多态性引起AZA治疗中不良反应的研究较多，但结论仍存在争议。因此，有必要研究在中国IBD患者中ITPA基因型和活性对AZA导致的不良反应的影响作用。　　 综上所述，GSTs和ITPA在AZA的代谢过程中起重要作用，其基因多态性和活性差异可能与AZA不良反应的个体差异有关。　　 因此，本研究拟以中国汉族IBD患者作为研究对象，以探讨GSTs和ITPA基因多态性和表型对AZA治疗过程中发生不良反应的影响，为临床更安全有效的使用AZA提供理论依据。　　 第一部分、GSTs活性和基因型检测。　　 目的：研究112名中国汉族IBD患者中GSTs基因多态性分布及红细胞内GSTs活性分布，考察与中国汉族健康人群间的差异。明确中国汉族IBD患者GSTs基因型和活性间的关系。　　 方法：采用多重PCR和PCR-RFLP的方法检测GSTs四个亚型突变位点GSTM1、GSTT1、GSTP1以及GSTA1在中国汉族IBD患者中的分布情况。采用紫外分光光度法检测红细胞内GSTs的活性。　　 结果：本部分研究中112例中国汉族IBD患者GSTM1、GSTT1、GSTP1以及GSTA1的突变频率分别为52.7％、50.9％、34.8％和20.5％。红细胞内GSTs活性经自然对数转换后呈正偏态分布，在患者中的GSTs突变频率和活性分布均与健康汉人中的结果相近，无统计学差异(P＞0.025)。其中GSTP1-105Val突变型红细胞内GST活性平均值较野生型活性平均值高(P=0.025)。GSTP1基因型突变对红细胞内GSTs活性有明显影响。而GSTM1、GSTT1和GSTA1基因型突变对活性的影响无统计学意义。　　 结论：本研究中IBD患者的GSTs基因型频率分布和活性与健康汉族人群中的分布无明显差异。GSTP1基因型突变对红细胞内GSTs活性的有明显影响，这与在中国汉族健康人群中GSTP1基因型与活性的关系一致。　　 第二部分、ITPA活性和基因型检测。　　 目的：建立HPLC方法检测红细胞内ITPA活性，并进行验证。研究83名中国汉族IBD患者中ITPA基因多态性分布及红细胞内ITPA活性分布，明确ITPA基因型和活性间的关系。　　 方法：用PCR-RFLP的方法检测ITPA两个突变位点ITPA 94C＞A和IVS2+21A＞C在中国汉族IBD患者中的分布情况。建立检测红细胞内ITPA的活性的HPLC方法。　　 结果：　　 1.建立了红细胞内ITPA活性的HPLC检测方法，方法学验证均符合生物样本检测的要求。　　 2.本部分研究中83例患者红细胞ITPA活性为双峰分布，活性平均值为231.4±93.3 U。性别间红细胞内ITPA活性差异无统计学意义。　　 3.本部分研究中ITPA 94C＞A突变杂合子发生频率为36.1％，此位点没有发现突变纯合子。未发现ITPA IVS2 21A＞C位点的突变个体。其中ITPA 94C＞A野生型患者红细胞内ITPA活性平均值高于突变杂合子活性(P=0.001)。ITPA94C＞A基因型突变对红细胞内ITPA活性的影响具有统计学意义。　　 结论：本部分建立并确证的HPLC方法可满足人红细胞内ITPA活性研究的要求。本研究中IBD患者的ITPA活性分布符合已报道的活性分布特征，ITPA94 C＞A基因型突变频率体现中国人高突变的基因型分布特征。ITPA 94C＞A基因型突变对红细胞内ITPA活性有明显影响。　　 第三部分、GSTs和ITPA基因型和表型与IBD患者服用AZA发生不良反应的相关性研究。　　 目的：研究GSTs和ITPA基因型和活性对AZA治疗IBD患者中发生不良反应的影响，为降低毒副反应，制定合理的AZA治疗方案提供理论指导。　　 方法：本部分研究在第1部分，第2部分研究的基础上，分析IBD患者GSTs和ITPA基因型和活性与使用AZA治疗后发生不良反应的相关性。采用单因素卡方分析基因型对骨髓抑制，胃肠道不适，感冒样症状的影响。采用单因素T-检验和非参检验考察酶活性与三组不良反应组之间的关系。最后通过多因素Logistics回归分析以确定影响最大的因素。　　 结果：　　 1.单因素分析结果：骨髓抑制组GSTM1野生型频率显著高于无不良反应组，骨髓抑制组患者携带GSTP1野生型的机率高于无不良反应组(P＜0.05)，骨髓抑制组的GSTs活性高于无不良反应组(P＜0.05)；感冒样症状组GSTM1野生型频率显著高于无不良反应组(P＜0.05)。而ITPA基因型和活性与各个不良反应组之间无显著性相关性(P＞0.05)。　　 2.多因素回归分析表明：其中GSTPI(I/V)突变型组与GSTP1(I/I)野生型组比较风险较低，是患者的保护因素(P＜0.05，OR 0.125，95％CI 0.022-0.709)。红细胞内GSTs活性高的患者发生骨髓抑制的风险是活性低的患者的11.680倍(P＜0.05，OR 11.680，95％CI 1.665-81.925)。GSTs基因型、活性以及参与的各相关因素与感冒样症状组和胃肠道不适组之间均无显著性统计意义(P＞0.05)。　　 结论：在使用AZA治疗的中国汉族IBD患者中，携带GSTP1野生基因型和GST酶活性高的患者有较大发生骨髓抑制的风险。提示对于携带GSTP1野生型，GSTs活性高的患者可考虑使用6-MP代替AZA治疗。　　 论文总结：本研究首次在中国汉族IBD患者中进行GSTs和ITPA基因多态性和活性研究，发现中国汉族人与中国汉族IBD患者的GSTs基因型分布频率和活性分布相近，患者中ITPA基因型与已报道的其他亚洲人种相近，而和高加索人的突变频率相比均有较大种族差异；利用本实验建立的HPLC方法，对IBD患者红细胞内ITPA活性进行检测，揭示了IBD患者ITPA活性分布与其他以报道的相似，但均值偏高。在回顾性分析发生不良反应的影响因素中，首先单因素分析GSTs和ITPA的基因多态性和活性与AZA治疗过程中不良反应发生的影响作用，发现GSTM1基因突变与骨髓抑制和流感样症状有关，GSTP1基因突变与骨髓抑制发生有关。GSTs活性与骨髓抑发生有关。而ITPA基因型和活性的作用无统计学意义。采用多因素Logistics分析研究GSTs基因型，活性以及临床特征对AZA不良反应的影响。发现在使用AZA治疗中患者携带GSTP1突变基因型是保护因素，较GSTP1野生型发生骨髓抑制的风险低，携带GSTP1野生型所发生不良反应的患者占全部骨髓抑制患者的91％，而GST酶活性高患者发生骨髓抑制的风险是低酶活性的患者的11.68倍。因此，对于携带GSTP1野生型，GSTs活性高的患者可考虑使用6-MP代替AZA治疗。没有足够的证据确定ITPA与不良反应之间有相关性，尚不能根据ITPA的基因型和活性来预测不良反应和调整治疗方案。本研究为临床制定合理的AZA治疗方案提供了理论依据。