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侵袭转移是恶性肿瘤病人死亡的主要原因。现在对侵袭转移的机理已有了较为深入的研究，侵袭转移主要包括血管生成、粘附、蛋白水解、迁移和增殖等步骤。如何有效抑制侵袭转移的各个步骤，成为抗肿瘤治疗的研究重点。十几年的研究表明，尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase plaminogen activator,uPA）及其受体(uPA receptor, uPAR)系统除在细胞外的蛋白水解中发挥关键作用外，还在血管生成、粘附、迁移和增殖等肿瘤侵袭转移的多个步骤中起着重要作用。故uPA/uPAR系统成为肿瘤抗侵袭转移治疗的靶标蛋白质。抑制uPA/uPAR的活性和干扰uPA与uPAR的之间的相互作用是肿瘤抗侵袭转移治疗研究的基本策略和思路，通过基因工程及蛋白质工程，把与uPAR结合的uPA氨基末端片段(amino-terminal fragment, ATF) 的cDNA通过含十一个氨基酸残基的连接肽编码序列与缺失了CD螺旋间区第33~98位氨基酸残基的、不再具有抵抗TNF-α 诱导的细胞凋亡作用的PAI-2突变体（PAI-2CD）cDNA重组成融合蛋白基因（ATF-PAI2CD），分别在酵母和大肠杆菌中表达。在酵母中表达的融合蛋白经超滤浓缩、凝胶过滤层析、离子交换层析等多步骤纯化后纯度达到95%，比活性为1.0×104 IU/mg，得率为1.1 mg/L，经流式细胞仪检测，该融合蛋白与95D细胞表面的uPAR能够特异性的结合；在大肠杆菌中表达的融合蛋白后经离子交换层析等步骤纯化后纯度达90%，比活性1.2×104 IU/mg，得率为50 mg/L，用放射竞争实验检测其能够与95D细胞表面的uPAR特异性结合。用改良Boyden小室分析PAI-2CD及融合蛋白对人巨细胞肺癌细胞95D株的体外侵袭能力的影响，在1、 5 、10、50、100、500、1000 nmol/L浓度下，经PAI-2CD处理的95D细胞穿过Matrigel的细胞数分别为80.33 ± 3.78、 76.50 ± 5.21、69.83 ± 5.04、65.67 ± 6.77、56.67 ± 5.50、33.17 ± 5.19、15.12 ± 3.74，经ATF-PAI2CD融合蛋白处理的95D细胞穿过Matrigel的细胞数分别为87.5 ± 4.03、73.24 ± 4.10、47.33 ± 4.13、29.17 ± 2.48、13.50 ± 2.07、10.83 ± 1.47、9.83 ± 1.33。与对照组相比，除1 nmol/L低剂量组外，PAI-2CD及ATF-PAI2CD两种蛋白都能剂量依赖性的抑制95D细胞体外侵袭（具有显著性差异，p<0.05）。融合蛋白ATF-PAI2CD抑制95D细胞的半数抑制浓度（IC50）约10 nmol/L，而PAI-2CD抑制95D细胞的 IC50约250 nmol/L，显示ATF-PAI2CD具有更强的抑制95D细胞体外侵袭能力（具有显著性差异，p<0.05）。说明融合蛋白的双功能作用比PAI-2CD的只具纤溶抑制活性更为有效。ATF-PAI2CD及PAI-2CD都能够通过干扰uPA系统介导的<WP=7>细胞外基质降解作用，抑制95D细胞的体外侵袭能力。Western blot 检测ATF-PAI2CD与95D细胞作用后细胞外调节激酶(ERK1/2) 的磷酸化水平，表明ATF-PAI2CD不影响非磷酸化的总ERK1/2蛋白的表达水平，但能下调95D细胞的细胞外调节激酶(ERK1/2) 的磷酸化水平，这可能也是融合蛋白抑制肿瘤细胞的体外侵袭能力的原因之一，这也解释了体内实验高剂量药物处理组明显抑制肿瘤生长。细胞粘附实验表明ATF-PAI2CD能够增强95D肺癌细胞与纤连蛋白的粘附，这可能也是融合蛋白抑制肿瘤细胞的体外侵袭能力的原因之一。按5 × 106细胞/只将95D细胞接种于5周龄雌性BALB/c nu/nu 裸小鼠肩胛部皮下，随机分为4组，从接种肿瘤细胞之日起，实验组每日分别腹腔注射0.5 μ g、5 μg、50 μg，同时对照组每日腹腔注射生理盐水。每周观察记录肿瘤的体积，70天后统一处死裸鼠。分离裸小鼠原位肿瘤、肺脏及淋巴结。结果显示，4组裸小鼠的成瘤率为100%，均无肺转移；ATF-PAI2CD融合蛋白高剂量治疗组（50 μg）的原位肿瘤重量为2.94 ±0.84 g 与对照组的原位重量9.29±1.74 g 相比，有显著性差异（p<0.05），而中剂量治疗组（50 μg）及低剂量组(0.5 μg)原位肿瘤重量分别为7.79±1.87 g和8.48±1.62 g，与对照组相比无统计学意义（p>0.05）；高、中剂量组肿瘤细胞的侵袭性相对于对照组有明显下降（p<0.05）；而低剂量组肿瘤细胞的侵袭性相对于对照组无明显差别（p>0.05 ），高剂量、中剂量、低剂量治疗组及对照组淋巴结转移率分别为28.6%、16.7%、100%、100%，高、中剂量治疗组与对照组相比，均有显著性差异（p<0.05），而低剂量组与对照组相比，无显著性差异（p>0.05）淋巴结转移结节数分别为0.43 ±0.79个、0.33±0.82个、7.86±1.21个、8.17±2.93个。表明ATF-PAI2CD融合蛋白虽未改变95D细胞的致瘤性，却能显著抑制95D细胞在裸小鼠体内的转移能力，且具有量效关系，而高剂量治疗组中ATF-PAI2CD融合蛋白还显示了其能够抑制肿瘤细胞生长。上述结果提示融合蛋白ATF-PAI2CD有望为抗肿瘤侵袭转移治疗提供新的治疗方法。