铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种重要的革兰氏阴性条件性致病菌,常分离于免疫功能受损的患者病灶中。与其他常见致病菌相比,铜绿假单胞菌具有相对较大的基因组和较多的基因组成,有利于铜绿假单胞菌快速适应各种环境和宿主组织。众所周知,群体感应系统(Quorum-sensing,QS)在调控铜绿假单胞菌毒力因子的合成和释放过程中发挥着至关重要的作用。通过靶向抑制群体感应系统进行新型抗菌药物研发已成为近些年的研究热点领域。本研究以铜绿假单胞菌为模式菌株,从多种化合物中筛选获得多种QS抑制剂,并进一步探讨了其作用机理。结果如下:将51种商用化合物分别加入到接种有铜绿假单胞菌的群体感应培养基(QS-required medium,QSM)和富营养培养基(LB),通过监测细菌生长状况,最终筛选获得五种能够显著抑制铜绿假单胞菌在QSM培养基中的种群增殖,但在LB培养基中无显著功效的化合物,即D-环丝氨酸,利巴韦林,二甲硝唑,白果内酯和阿卡地新磷酸盐。通过对铜绿假单胞菌绿脓菌素、水解酶、胞外蛋白酶和生物膜产量的测定,综合评估五种化合物对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制活性。结果表明,D-环丝氨酸具有一定的绿脓菌素、胞外蛋白酶、水解酶和生物膜抑制活性。利巴韦林可显著抑制绿脓菌素、胞外蛋白酶、水解酶和生物膜的产生。另外,利巴韦林对绿脓菌素分泌和胞外蛋白酶活性的抑制具有明确的量效关系,最低有效抑制浓度为50μM。二甲硝唑可以显著抑制绿脓菌素、胞外蛋白酶和水解酶的产生,但对生物膜的抑制作用不明显,而且二甲硝唑对胞外蛋白酶活性的抑制同样具有明确的量效关系,最低有效抑制浓度为50μM。此外,白果内酯和阿卡地新磷酸盐可以显著抑抑制绿脓菌素和生物膜的产生,其中白果内酯对绿脓菌素的抑制具有明确的量效关系,最低有效抑制浓度为50μM。基于秀丽隐杆线虫-铜绿假单胞菌Fast-killing和Slow-killing感染模型,评估五种化合物的对秀丽隐杆线虫的保护作用。结果显示在Fast-killing试验中,D-环丝氨酸,利巴韦林和白果内酯对线虫的保护作用较二甲硝唑和阿卡地新磷酸盐更为显著,线虫的存活率分别为89%、78%、78%。在Slow-killing试验中,利巴韦林,二甲硝唑,白果内酯和阿卡地新磷酸盐对铜绿假单胞菌感染的保护作用较D-环丝氨酸更为显著,并且二甲硝唑处理组线虫的存活率最高(78%)。最后,选择利巴韦林和二甲硝唑开展进一步的作用机理研究。转录组分析结果显示,利巴韦林处理后的铜绿假单胞菌中有403个基因上调和412个基因下调。差异表达基因的功能聚类分析表明显著下调的基因主要富集在细胞组分(Cellular component)。KEGG代谢通路预测结果表明核糖体相关基因的表达被完全抑制。进一步分析发现利巴韦林处理后的铜绿假单胞菌共有131个受QS系统正向调控的基因表达量受到显著影响,包括61个上调基因和70个下下调基因。值得注意的是,QS主控基因、自诱导信号分子合成蛋白编码基因、下游弹性蛋白酶、鼠李糖脂、运动和附着以及其他相关功能基因均被利巴韦林显著抑制。另一方面,二甲硝唑的处理后的铜绿假单胞菌中共581个基因显著上调,1027个基因显著下调。KEGG代谢通路预测结果显示,铜绿假单胞菌生物膜形成和分泌系统及其他相关基因被二甲硝唑显著抑制。在145个受二甲硝唑影响而显著差异表达的QS系统正向调控的基因中,有134个基因的表达量均显著下调,包括QS主控基因、自诱导信号分子合成蛋白编码基因、下游弹性蛋白酶、鼠李糖脂、甲基趋化蛋白、主要易化子超家族以及运动和附着相关的基因簇。实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)结果进一步证实,利巴韦林和二甲硝唑均可同时抑制典型的QS正向调控基因(如las R、las B、rhl R、rhl A、pqs R、pqs A和pqs D)的表达。本研究基于一系列商用小分子进行了铜绿假单胞菌QS系统抑制剂的筛选和作用机制研究,最终获得了五种可以显著抑制QS系统相关表型的候选化合物,并证明其可以有效保护秀丽隐杆线虫免受铜绿假单胞菌侵染,尤以利巴韦林和二甲硝唑两种化合物的体内外作用功效最为显著。转录组分析和实时荧光定量PCR验证结合进一步研究确证了利巴韦林和二甲硝唑可以显著抑制铜绿假单胞菌QS系统。这些发现为未来抗毒力药物的开发提供了重要的方法学支撑和结构基础参考。