目的：本研究以氟砷染毒的成骨细胞（OB）为研究对象，以成骨细胞增殖变化过程中OPG/RANKL轴及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白、基因的表达和改变为切入点，分别观察OPG/RANKL轴及Wnt/β-catenin信号通路在氟、砷和氟与砷暴露对成骨细胞的作用，以期为探寻氟砷联合骨骼毒作用的分子机制，寻找氟砷联合中毒骨骼损害基因靶标、干预位点及氟骨症的治疗靶点提供依据。　　方法:1.细胞的分离培养与鉴定：将采用胰蛋白酶和胶原酶消化法从新生SD大鼠颅盖骨分离并经差速贴壁法纯化得到的细胞进行培养，结合细胞形态、碱性磷酸酶及茜素红化学等方法对细胞进行鉴定。2.剂量设计与分组：根据文献及预实验，确定氟、砷及氟砷联合染毒剂量：单独氟染毒剂量为0、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mmolF-/L，单独砷染毒剂量为0.1、1.0、10.0μmolAs3+/L；根据各单独染毒组OB增殖与分化情况选择增殖变化较明显的氟（0.5、4.0 mmol F-/L）和砷（0.1、10.0μmol As3+/L）进行析因设计，分别为对照组（0 mmol F-/L+0 umol As3+/L）、低氟组（简称F0.5组）、高氟组（简称F4.0组）、低砷组（简称As0.1组）、高砷组（简称As10.0组）、低氟低砷组（简称F0.5As0.1组）、低氟高砷组（简称F0.5As10.0组）、高氟低砷组（简称F4.0As0.1组）、高氟高砷组（简称F4.0As10.0组），分析氟砷联合暴露对OB增殖分化的影响。3.采用实时荧光定量PCR（Quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）法检测72h氟、砷及氟砷联合暴露下细胞中wnt/β-catenin信号通路中各组分及骨保护素（Osteoprotegerin， OPG）、破骨细胞分化因子（Receptor activator of NF-kappaB ligand，RANKL） mRNA表达；用Westen blot检测Wnt/β-catenin信号通路中胞内蛋白糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，Gsk-3β）、β连环蛋白（β-catenin）、Runt相关转录因子-2（Runt homology domain transcription factor2，Runx2）、NF-κB1、T-细胞因子（T-cell factor-1，TCF-1）的变化；采用Elisa法检测培养液中OPG、RANKL蛋白，Wnt/β-catenin信号通路中胞外蛋白及Wnt3a、Wnt10b、R-spondin1蛋白，胞外拮抗剂Dkk1、Dkk2、骨硬化蛋白（Sclerostin，Sost）、分泌卷曲相关蛋白（Secreted Frizzled-related proteins，Sfrp1）蛋白的水平。　　结果：1.从新生SD大鼠颅盖骨分离得到的细胞，经体外培养后的细胞经鉴定具有典型的OB表型特征，能够分泌碱性磷酸酶、并能形成矿化结节。2.氟离子终浓度0.01~1.0 mmol/L剂量时表现为促进成骨细胞增殖和ALP活性，而在氟剂量在>2.0mmol/L时表现为抑制作用。0.1μmol/L的砷表现为促进细胞增殖作用而相对抑制分化作用，10.0μmol/L的砷表现为抑制成骨细胞增殖作用而相对促进成骨细胞分化作用。3.氟砷联合暴露对成骨细胞的影响：3.1氟砷交互作用：As0.1拮抗F0.5的促OB增殖、分化的作用；As10.0与F0.5联合作用时，显著抑制OB的增殖作用；高氟与低砷或高砷联合作用时，主表现为高氟对OB的损伤作用。3.2氟砷联合暴露对成骨细胞OPG-RANKL系统的影响：F0.5上调OPG、RANKL、Runx2、NF-κB1 mRNA及蛋白的表达（P<0.05），上调OPG/RANKL mRNA及蛋白比值（P<0.05），F4.0下调OPG、RANKL、Runx2、NF-κB1 mRNA的表达（P<0.05），对Runx2、NF-κB1蛋白降低明显（P<0.05），对OPG、RANKL蛋白降低不明显（P>0.05），下调OPG/RANKL mRNA及蛋白比值（P<0.05）；砷单独作用下调RANKL、NF-κB1 mRNA及蛋白的表达（P<0.05），上调Runx2 mRNA表达，但降低Runx2的蛋白水平（P<0.05），对OPG mRNA及蛋白的影响不明显（P>0.05），As0.1、As10.0拮抗F0.5的作用，降低F0.5As0.1、F0.5As10.0组OPG mRNA及蛋白、RANKL蛋白、Runx2 mRNA蛋白、NF-κB1蛋白的表达（P<0.05），F4.0拮抗As0.1的作用，降低OPG mRNA的表达（P<0.05），F0.5组、As10.0相互拮抗，显著上调RANKL/OPG蛋白比值（P<0.05），As0.1拮抗F0.5的作用，降低RANKL mRNA的表达（P<0.05）， As0.1、As10.0拮抗F4.0的作用，降低RANKL蛋白、RANKL/OPG蛋白比值（P<0.05）， F0.5As10.0组、F4.0As0.1组RANKL mRNA的表达降低明显（P<0.05），F0.5 As0.1组与F0.5组比较、F0.5As10.0与As10.0比较，上调RANKL/OPG mRNA比值（P<0.05）， F4.0As0.1，显著升高NF-κB1蛋白水平,促进Runx2 mRNA及蛋白分泌（P<0.05）。3.3氟砷联合暴露对成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响：氟、砷对胞内核蛋白的影响：F0.5上调β-catenin mRNA及蛋白的表达（P<0.05），F4.0对β-catenin mRNA的表达影响不明显，但明显降低β-catenin蛋白含量（P<0.05），As0.1上调β-catenin mRNA的表达明显（P<0.05），As10.0上调β-catenin mRNA的表达不明显（P>0.05），但均明显降低β-catenin蛋白水平（P<0.05），氟及砷均下调Gsk-3βmRNA及蛋白的表达（P<0.05），氟明显降低TCF-1蛋白水平（P<0.05）；As0.1、As10.0拮抗F0.5，As0.1拮抗F4.0的作用，上调Gsk-3βmRNA的表达，但降低Gsk-3β蛋白的含量（P<0.05），As0.1、As10.0拮抗F0.5，下调β-catenin mRNA的表达，但降低β-catenin、TCF-1蛋白的含量（P<0.05），F4.0As0.1组显著上调β-catenin、TCF-1蛋白的含量（P<0.05）。氟、砷对胞外配体及激动剂的影响：F0.5上调Wnt3a、Wnt10b的分泌（P<0.05），降低R-spondin1 mRNA及蛋白的表达不明显（P>0.05），F4.0对Wnt3a蛋白的影响不明显（P>0.05）、显著降低Wnt10b蛋白及R-spondin1 mRNA及蛋白的表达（P<0.05）；砷促进Wnt3a蛋白的分泌（P<0.05），抑制R-spondin1蛋白的分泌（P<0.05），As0.1明显降低Wnt10b蛋白的分泌，对R-spondin1 mRNA的表达作用不明显（P>0.05），As10.0降低Wnt10b蛋白不明显（P>0.05），显著抑制R-spondin1 mRNA的表达；F0.5As0.1组和F4.0As0.1组的Wnt3a蛋白含量高于相应F0.5组、F4.0组（P<0.05），F4.0拮抗As10.0，降低Wnt3a蛋白的分泌（P<0.05），As0.1拮抗F0.5的作用，降低Wnt10b蛋白含量（P<0.05），F0.5As10.0显著下调Wnt10b蛋白含量（P<0.05），而F4.0As0.1组、F4.0As10.0组显著上调Wnt10b蛋白含量（P<0.05）。氟、砷对胞外抑制剂的影响：F0.5对Dkk1 mRNA及蛋白的表达改变不明显（P>0.05），F4.0显著上调Dkk1 mRNA的表达，但对Dkk1蛋白的影响不显著（P>0.05），砷下调Dkk1 mRNA的表达（P<0.05），氟及As10.0均上调Dkk2 mRNA及蛋白的表达（P<0.05），F0.5升高Sost蛋白明显（P<0.05）， F4.0升高Sost蛋白不明显（P>0.05），砷对Sost蛋白作用不明显（P>0.05），氟对Sfrp1蛋白水平的影响不明显（P>0.05），砷显著降低Sfrp1蛋白水平；F0.5As0.1组的Dkk1 mRNA及蛋白高于As0.1组（P<0.05），F4.0As10.0组下调Dkk1 mRNA及蛋白含量（P<0.05），F4.0与As0.1相互拮抗Dkk1 mRNA的表达（P<0.05），F0.5As0.1组显著上调Dkk2 mRNA及蛋白含量，F0.5As10.0组Dkk2蛋白高于F0.5，但Dkk2 mRNA的表达低于F0.5组，F4.0As0.1组Dkk2 mRNA及蛋白高于As0.1组， F0.5As0.1组、F4.0As0.1组、F4.0As0.1组、F4As10.0组的Sost蛋白含量均高于对照组，但均低于相应单独组蛋白水平之和（P<0.05），As0.1、As10.0分别拮抗F0.5、F4.0的作用，降低Sfrp1蛋白的含量（P<0.05）。　　结论：1.氟、砷暴露剂量的不同对OB增殖分化作用的影响表现为双向调节作用：F0.5促进OB的增殖、分化，下调RANKL/OPG比值加快骨转换比率，促使骨重建向成骨方向的持续发生，F4.0则表现为高氟对OB存活的毒性作用；As0.1刺激OB增殖、抑制OB的分化，As10.0抑制OB的增殖、促进OB的分化，主表现为相对降低破骨细胞的溶骨作用，维持骨稳态的平衡；砷通过拮抗F0.5对成骨细胞增殖分化作用，并相对上调RANKL/OPG比值延缓骨重建向成骨方向发展的速度；As0.1拮抗F4.0的加快骨转换速度，抑制破骨细胞的溶骨作用，延缓向骨质疏松方向发展；As10.0加重F4.0的毒性作用。2.氟或砷均可以通过影响Wnt/β-catenin信号通路的胞外配体调控OB的增殖和分化，影响骨形成，并通过调控胞内β-catenin来影响RANKL/OPG轴的变化，进而调控破骨细胞的分化及成熟，改变骨重建方向。