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目的:1、探讨IL-6在小鼠和人卵巢衰老过程中的表达变化,以及IL-6对小鼠卵泡发育成熟的影响,初步探究其分子机制。在此基础上,探索IL-6信号通路抑制剂托珠单抗能否提高年老小鼠卵巢对促性腺激素的反应性,改善老年小鼠的卵母细胞质量,从而为提高高龄妇女的生育结局提供新的策略和治疗方法。2、探索新型转录本环状RNA在女性颗粒细胞中的表达及其在衰老中变化,揭示与卵巢储备和卵母细胞质量下降有关的环状RNA。材料与方法:1、ELISA、免疫化学和蛋白免疫印记分析IL-6在不同年龄阶段小鼠和人卵巢组织中的表达变化;基于卵泡三维培养体系,用不同浓度的IL-6处理小鼠窦前卵泡,观察IL-6对卵泡直径增长的影响,化学发光免疫技术检测雌孕激素生成,通过qRT-PCR、免疫荧光、体外成熟以及电镜评估其对卵母细胞发育成熟的作用,TUNE和蛋白免疫印记等检测凋亡、自噬相关蛋白和信号分子表达。利用卵巢间质细胞与卵泡共培养体系,将托珠单抗加入年老小鼠卵巢间质细胞培养基中,观察其对卵泡发育成熟的影响;用不同浓度的托珠单抗处理9月龄生殖衰老小鼠,1个月后检测小鼠卵巢对促性腺激素的反应性,免疫荧光观察卵母细胞减数分裂,MitoTracker检测卵母细胞线粒体分布,ELISA检测血清AMH、雌激素和孕酮的水平,蛋白免疫印记技术检测凋亡蛋白、自噬相关蛋白及JAK/STAT3的表达。2、收集2015年1月到2015年8月期间在同济医院生殖中心进行体外受精一胚胎移植患者的颗粒细胞,共126例。通过芯片检测人颗粒细胞中环状RNA表达模式随年龄的变化,qRT-PCR在20对样品中验证差异表达的环状RNA。RNaseR消化法和Sanger测序鉴定环状RNA的稳定性及成环位点。在另一独立队列80例样品中分析候选环状RNA与卵巢储备标记物和辅助生殖技术结局的相关性,并评估其预测价值;最后利用生物信息学方法预测这些候选环状RNA参与的生物学过程和信号通路。结果:1.IL-6在小鼠和人卵巢中的表达随着增龄而显著增加,与年龄呈显著的正相关关系。高浓度的IL-6显著抑制窦前卵泡的生长和雌孕激素的生成,并降低卵母细胞特异性基因的表达,阻碍卵母细胞减数分裂能力的恢复。高浓度IL-6处理的卵泡中卵母细胞超微结构严重受损,可见受损线粒体的聚集,伴随ROS生成增加。IL-6对卵泡的负向调控可能与它激活促凋亡蛋白、降低抗凋亡蛋白、抑制自噬活性有关。有趣的是,体内实验结果表明,与老年对照组小鼠相比,IL-6信号通路抑制剂托珠单抗能提高老年小鼠卵巢对促性腺激素的反应性增加获卵数,降低卵母细胞异常减数分裂的发生,改善卵母细胞内线粒体集聚,提高年老小鼠血清AMH和雌激素水平。托珠单抗对老年小鼠卵巢的保护作用可能与它抗凋亡和提高自噬活性有关。2.芯片结果显示人颗粒细胞环状RNA表达谱在女性衰老进程中发生显著改变,而且通过 qRT-PCR 确认了 circRNA103829、circRNA103827、circRNA104816 和circRNA101889的表达差异。在校正促排卵方案的影响后,circRNA103827和circRNA104816水平仍与女性年龄显著正相关。此外,颗粒细胞中这两个环状RNA的表达水平与血清AMH、AFC、获卵数和优质胚胎数呈显著负相关关系。ROC曲线分析表明circRNA103827和circRNA104816对临床妊娠结局具有一定的预测价值,其中circRNA103827用于活产的预测性能为0.698[0.570-0.825],灵敏度为77.2%,特异性为60.9%（P=0.006）,circRNA104816的预测价值为0.645[0.507-0.783]（P = 0.043）。生物信息学分析显示这两个环状RNA可能参与了能量代谢、细胞周期等生物学过程,以及类固醇激素生成、细胞粘附等信号通路。结论:1.IL-6在人和小鼠卵巢中的表达均呈增龄性的升高,升高的IL-6是窦前卵泡发育的负向调节因子,能引起卵泡发育成熟障碍和类固醇激素生成受损。它对卵泡发育成熟的调控作用可能与促凋亡、抑制自噬活性以及受损线粒体的集聚有关。此外,IL-6抑制剂托珠单抗注射能提高老年小鼠卵巢对促性腺激素的反应性,改善老年小鼠恶化的卵母细胞质量。因此,随年龄增长而升高的IL-6可能是导致女性内分泌功能异常、卵母细胞质量下降和卵巢低反应性的重要因素,阻断IL-6信号通路有望成为新的提高高龄妇女生育结局和延长卵巢寿命的方法。2.人颗粒细胞中环状RNA的表达受年龄的影响,随年龄增长而显著上调的circRNA103827和circRNA104816可能是卵泡微环境损伤的潜在指标,对体外受精的妊娠结局具有一定的预测价值。阐明这些环状RNA的生物学功能将有助于揭示卵母细胞质量下降的分子机制,改善个性化辅助生殖技术的治疗策略,提高高龄不孕女性的妊娠结局。