基于转录组测序miRNA调控银杏年龄途径开花机理研究

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银杏童期及花芽分化阶段过长,极大的阻碍了对其开花调控的研究,因此从分子层面揭示银杏年龄途径调控开花的机理尤为重要。本研究以银杏幼年、开花一年、开花多年的茎端/花芽为实验材料,利用高通量测序技术与生物信息学技术相结合的方法,鉴定和分析了银杏三个年龄阶段调控开花的重要基因和miRNA,并构建了银杏年龄途径调控开花网络预测图。主要研究结果如下:(1)利用高通量测序技术,构建了 9个小RNA文库,共得到151.46M Clean Reads,各样品不少于13.34MClean Reads,Q30均在98%左右。从小RNA文库中共鉴定出了 594个miRNA,已知miRNA89个,新预测miRNA505个,其中286个miRNA鉴定到隶属于97个miRNA家族。使用TargetFinder软件对miRNA进行靶基因预测,结果显示,共预测到12762个靶基因,其中11210个靶基因从数据库中获得注释信息。(2)对miRNA的差异表达进行分析,共筛选出30个具有显著表达差异的miRNA。利用 GO(Gene Ontology)富集分析以及 KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)pathway分析,对差异表达miRNA所调控靶基因之间的DEGs进行功能分类。结果表明,生物调控途径富集到24个基因,植物激素信号转导富集到13个基因,生殖过程富集到5个基因,植物生长富集到2个基因,这些基因可能与银杏开花调控相关。进一步对miRNA及靶基因的表达模式分析发现,miR156和miR172表达模式不明显,而miR159、miR319、miR7127以及其负调控的靶基因表达模式清晰,在银杏年龄途径调控开花过程中起着复杂的调控作用。经qPCR验证,所筛选出的差异表达miRNA的表达趋势与转录组数据结果基本一致。(3)转录组测序共获得57.45Gb的高质量数据,Q30碱基百分比在94.59%及以上。序列比对发现,与银杏基因的同源基因数量最高(10,816,31.18%)的是裸子植物北美云杉(Picea sitchensis),其次是无油樟(Amborella trichopoda)(3,677,10.60%),再其次是莲(Nelumbo nucifera)(2,707,7.82%);KEGG 注释结果显示,银杏茎端/花芽的Unigene在三个年龄阶段共涉及126个代谢通路,其中淀粉和蔗糖代谢(304个基因)、植物激素信号转导(302个基因)、泛素介导的蛋白质水解(222个基因)和植物昼夜节律(72个基因)4个代谢通路中富集的基因可能在花芽诱导成花过程中扮演着不可或缺的作用。(4)差异基因分析表明,银杏幼年茎端vs.开花一年花芽上调基因(37个)和下调基因(75个)较少,而幼年茎端vs.开花多年花芽的上调基因(592个)和下调基因(871个)与开花一年花芽vs.开花多年花芽的上调基因(961个)和下调基因(1203个)均较多。对差异表达基因进行KEGG和GO富集分析,最终在银杏三个年龄阶段中,筛选出11个开花相关的候选关键基因:SPL(gene.Gb23724、gene.Gb03922)、AP2(gene.Gb00766)、MADS-box(gene.Gb01886、gene.Gb15398、gene.Gb28337、GingkonewGene2213)、GA调节蛋白(gene.Gb34467、gene.Gb28606、gene.Gb33214)和 DELLAs 蛋白(gene.Gb34644)。(5)经转录组和small RNA测序联合分析,构建出银杏年龄途径开花调控网络:其一是miRNA7127、SPL、AP2及SOC1为主的调控方式;其二是GA调控蛋白、DELLAs、miRNA159、MYB转录因子和miRNA319为主的调控开花途径。推测在银杏中,开花的年龄调控与赤霉素调控还未明确分离开来,共同依赖于年龄,调控开花。
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